制备抗磷酸肽的抗体（即识别磷酸化肽的抗体）是可能的，该抗体只识别处于磷酸化状态的蛋白质，而不会与非磷酸化的同类蛋白质或其他磷酸蛋白质发生交叉反应。由于磷酸化经常意味着蛋白质处于功能状态或活性状态，因此这种抗体是蛋白质功能状态的一种便利的探针。与常规抗体不同的是，抗磷酸肽的抗体不仅能提供蛋白质含量的信息，还能提供其活性信息。多克隆抗体的纯化包含多步亲和层析以对具有合适反应性的抗体进行阴性筛选和阳性筛选。来源于《精编分子生物学实验指南（第五版）》

操作方法

基本方案

材料与仪器

用磷酸肽-BSA 交联物免疫过的兔的粗制血清
PBS／叠氮化物 MgCl2
分光光度计 透析袋 填装有 BSA-琼脂糖亲和介质的柱子 填装有磷酸酪氨酸亲和介质的柱子 填装有同种非磷酸肽亲和介质的柱子 填装有同源的磷酸肽亲和介质的柱子 填装有阳性-筛选的磷酸肽亲和介质的柱子

步骤

1. 将填装有 BSA-琼脂糖亲和介质的柱子和填装有磷酸酪氨酸亲和介质的柱子以串联的方式连接好。

2. 使大约 15 ml 的粗制血清通过重力作用流过两根柱子。用 PBS／叠氮化物溶液洗涤直到所有的黄色血清穿过柱子（或用分光光度计检测流出液体的 A₂₈₀ 直至达到基底吸收值），再用 5~10 ml PBS／叠氮化物溶液洗涤，收集所有穿过柱子的洗涤液，其中可能含有所要的抗体。

待血清过柱后，可用以下步骤使柱子重生：依次用 10 倍柱床体积的 3 mol/L NaSCN 和 10 倍柱床体积的 PBS／叠氮化物溶液洗涤柱子，然后在 PBS / 叠氮化物溶液中储存于 4℃ 待用。

3. 使过柱后的血清通过重力作用反复多次流过填装有非磷酸肽亲和介质的柱子以尽可能地去除交叉反应，在每两次过柱之间依次用 10 倍柱床体积的 3 mol/L NaSCN 和 10 倍柱床体积的 PBS/叠氮化物溶液洗涤柱子以使柱子重生。

4. 如果预期与同源磷酸蛋白质有交叉反应，用步骤 3 中的方法使上步过柱后的血清流过填装有同源磷酸肽亲和介质的柱子。

5. 在收集阳性-筛选亲和纯化的馏分之前，预先浸润并洗涤长约 25 cm 的透析袋。用透析夹夹住一端并检查是否漏液。同时预先准备 6 L PBS／叠氮化物透析液并冷却到 4℃。

6. 将上一步层析后过柱的血清流过阳性-筛选磷酸肽亲和柱 3 次，每次过柱后不要洗涤柱子。

7. 收集最后一次流过柱子的血清，然后用 5～20 ml PBS／叠氮化物溶液（用量取决于预柱体积和柱床体积洗涤柱子，将洗涤液与过柱的血清合并。再用 20 ml PBS／叠氮化物溶液洗涤柱子，洗涤液分开收集以作为「洗涤」馏分。

8. 选用下列离液剂进行洗脱：20 ml 3 mol/L NaSCN, 或依次用 10 ml 3.5 mol/L MgCl₂ 和 10 ml 4.5 mol/L MgCl₂。开始洗脱后，立即收集约 3 ml 洗脱馏分直接到步骤 5 中准备的透析袋中，用透析袋夹夹住透析袋的近端并立即放入 PBS／叠氮化物透析液。至少收集 6 次洗脱馏分。

9. 将步骤 8 中收集的洗脱锻分于 4℃ 对 PBS／叠氮化物溶液进行透析。

10. 通过测量 280 nm 处的吸光值或蛋白质比色测量法测量并计算出透析馏分中蛋白质的产量。从 15 ml血清样品中通常可得到 > 1 mg 纯化抗体。

11. 将抗体分装成小份并储存于 - 70℃；作为工作液的部分储存于 4℃。

12. 用 ELISA 和免疫印迹检测最终样品以及前面各步收集到的馏分的反应性和交叉反应性。

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