转录过程中的 RNA 分子内标记，转录后利用 T4 多核苷酸激酶的 RNA5＇端标记和利用 T4RNA 连接酶的 RNA3＇端标记。

操作方法

RNA放射性标记

材料与仪器

[α32P]UTP 或 CTP(800Ci ml 10mCi ml) UTP 或 CTP T4 多核苷酸激酶 (γ32P)ATP 牛小肠磷酸酶 T4RNA 连接酶 [32P]pCpATP 2Oumol L 无 tRNA 酶的牛血清白蛋白
10XT4 多核苷酸激酶缓冲液 DEPC 处理的水 10X 磷酸酶缓冲液 TE(pH7.4) 5mol LNaCl TE(pH7.6) 10XT4RNA 连接酶缓冲液 DMSO

步骤

一材料与设备

1)[α³²P]UTP 或 CTP(800Ci/ml,10mCi/ml)。

2)UTP 或 CTP。

3)T4 多核苷酸激酶

4)10XT4 多核苷酸激酶缓冲液

5)(γ³²P)ATP(3000Ci/mmol；10mCi/ml)

6) 牛小肠磷酸酶

7)DEPC 处理的水

8)10X 磷酸酶缓冲液

9)TE(pH7.4)

10)5mol/LNaCl

11)TE(pH7.6)

12)T4RNA 连接酶

13)[³²P]pCp(3000Ci/mmol；lOmCi/ml)

14)10XT4RNA 连接酶缓冲液

15)DMSO

16)ATP，20umol/L。

17 无 tRNA 酶的牛血清白蛋白

二、操作方法

(一）RNA 内部标记

1) 在体外转录体系中加入 5ul[α³²P]UTP 或 CTP(800Ci/ml，10mci/ml），不加未标记的 UTP 或 CTP 或限制它们的浓度为 10〜15umol/L, 孵育时间最长为 1 h

2)DNase 消化后，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 RNA, 纯化标记的全长 RNA。

(二）5＇端标记 RNA

逋过 T4 多核苷酸激酶在 5＇端标记 RNA。这个酶将 [32P] 由 [γ-³²P]ATP 上转移到分子的 5＇端. 伹 5＇端标记的 RNA 分子需要先用牛小肠磷酸酶去除非同位素的 5＇磷酸。

1) 用 DEPC 处理的水稀释 1〜2ugRNA 至终体积为 16ul,95℃ 下放置 2 min 后，冰浴5 min, 变性 RNA

2) 加入 2ul10X 磷酸酶反应缓冲液，2ul 牛小肠磷酸酶 (1U/ul);37℃ 反应 30 min

3) 用 TE(pH7.4) 稀释 RNA 至终体积为 200ul, 加 6ul5mol/LNaCl 如前所述沉淀RNA。

4) 用 TE(pH7.6) 重悬 RNA 至 RNA 浓度为 0.5ug/ul。取 2ulRNA 溶液，95℃ 放置 2 min 后，冰浴 5 min

5) 加 10XT4 多核苷酸激酶缓冲液 4ul[γ³²P]ATP(3000Ci/mmol,10mCi/ml),iyT4 多核苷酸激酶 (3〜6U/ul)，于 37°C 孵育 30 min

6) 用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化已标记的 RNA

(三）3＇端标记 RNA

利用 T4RNA 连接酶和过量的 [32P]p4 以标记 RNA 的 3＇端

1) 将 1〜2ugRNA 于 68℃ 放置 2 min 后，冰浴 5 min, 使之变性

2) 加入 4ul10XT4RNA 连接酶缓冲液，4ul DMSO，1ul20umol/LATP,1ul l0ug/ml 无 RNA 酶的牛血清白蛋白，1〜2ug RNA,5〜10ul[³²P]pCp(3000Ci/mmol,lOmCi/ml)，用 DEPC 处理水补足总体积 40ul。4°C 孵育过夜。

3) 用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化已标记的 RNA。

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