甲苯胺蓝染色实验
甲苯胺蓝是常用的人工合成染料的一种,属于醌亚胺染料类,这类染料一般含有两个发色团,一个是胺基,一个是醌型苯环,来构成色原显色。染料除有发色团外,还要有能使色原对
用于检测、定量和定位抗原与抗体的技术——ELISA、免疫印迹、免疫组化与流式细胞术。以下是我们知识库中标注该主题的实验方案、常见问题与技术文章。
甲苯胺蓝是常用的人工合成染料的一种,属于醌亚胺染料类,这类染料一般含有两个发色团,一个是胺基,一个是醌型苯环,来构成色原显色。染料除有发色团外,还要有能使色原对
这种染色方法的基础是组织结构对不同染料的结合程度不同。染料苏木精可以将嗜碱性结构染成蓝紫色,而伊红可以将嗜酸性结构染成粉红色。嗜碱性结构通常包括含有核酸的部分,
对细胞的染色可以(1)让细胞着色便于观察;(2)对凋亡细胞的检测。
细胞RNA的原位杂交实验用于在混杂的细胞群体和组织中、定位特异的mRNA在细胞中的存在位置。
脊索瘤相关基因鉴定及筛查实验,用于(1)脊索瘤分子机制(2)基因诊断(3)基因治疗。
细胞RNA的原位杂交实验用于在混杂的细胞群体和组织中、定位特异的mRNA在细胞中的存在位置。冰冻切片(frozen section)是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度,然后
由于一些组织(如胰脏和睥脏)含有高浓度的内源性 RNA 酶,因此纯化源于组织的 RNA 须更加小心。
通过硫氰酸胍提取和氯化铯离心法制备 RNA,适于分离细胞质和细胞核难分开的细胞以及富含 RNase 的细胞中的 RNA。
本方法是分离蛙、海 胆 、被囊动物、蠕虫和蝇的卵母细胞、受精卵及其胎细胞 RNA 的简便有效的方法。
下述方法是纯化组织培养细胞胞质 RNA 的 简便并行之冇效的方法 ,此方法出现在 RNA 分离的较早阶段,主要步骤即离心去除细胞核
病毒RNA提取可以:(1)用于RNA病毒复制机制研究;(2)用于反向遗传学研究;(3)用于分子病毒学其他研究。
本实验主要用于判断RNA提取物的完整性。
通过体外无细胞系统翻译找出目的基因mRNA以后,变可进行cDNA第一链的合成,其步骤如本文所介绍.
全血RNA的提取可用于:(1)研究RNA干扰机制等;(2)用作反转录模板;(3)分子生物学其他研究。
Northern blot 是研究基因表达的最严谨的方法之一,可以定量分析组织中某一特异 mRNA 的表达丰度,根据其迁移位置也可以判断基因表达转录物的大小。该技术应用十分广泛,常
利用cND A微阵列技术可用于:(1)并行分析检测成千上万个基因的表达情况;(2)在新基因的发现、基因组功能的研究、疾病的预测和诊断、药物靶标的确定和药物毒性预测等多
由于RNA的种类来源很多,因而提取制备方法各异,一般有苯酚法,去污剂法和盐酸胍法,其中苯酚法实验室最常用。组织匀浆后用苯酚处理离心,RNA即溶于上层被酚饱和的水相中,
由于RNA的种类来源很多,因而提取制备方法各异,一般有苯酚法,去污剂法和盐酸胍法,其中苯酚法实验室最常用。组织匀浆后用苯酚处理离心,RNA即溶于上层被酚饱和的水相中,
真菌RNA的提取可以:(1)用于真菌RNA干扰机制研究;(2)用于cDNA文库构建等研究;(3)用于真菌分子生物学相应研究。
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尽管从其他细胞也可以制备染色体,但人类外周血白细胞是最容易同步化的,从而可以对其染色体进行高分辨分析。
前接体是真核细胞核内剪接 mRNA 前体的大分子核糖核蛋白复合体,它由 5 种 snRNP 和大量的非 snRNP 蛋白组成,每一种 snRNP 由一个 snRNA 和几种蛋白质构成。本实验来源「R
剪接体是由 RNA 和蛋白质构成的核糖核蛋白体(RNP),它在前体 mRNA 的剪接过程中可去除前体 mRNA 的内含子。snRNP 是由 snRNA 及其结合蛋白组成,在前体 mRNA 的剪接过程起
剪接反应的典型做法是使用核提取物,即 S100 提取物补充 SR 蛋白或粗提取物的部分纯化组分,最常使用的是 HeLa 细胞的提取物。前体 mRNA 底物通常采用噬菌体聚合酶体外转录
在核内,RNA 聚合酶 Ⅱ 的转录产物同大量不同类型的核前体 mRNA/mRNA 结合蛋白,不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucUoprotein,hnRNP) 结合形成 hnRNP 复合
RNA 免疫沉淀-随机聚合链反应方法可用来鉴定细胞内 RNP 复合物中的 RNA 组分。本实验来源「RNA 实验指导手册」主编:郑晓飞。
随着体外分子实验技术的发展,近年来相继发现了许多具有不同催化功能的 DNA 分子,这些被称为脱氧核酶的催化型 DNA 分子可以催化切割反应、连接反应、卟啉环金属化等许多化
亚甲基蓝介导的光交联反应是对紫外交联反应的一个补充。亚甲基蓝属于酚噻嗪类染料。由于其环结构,亚甲基蓝可以在较低的浓度同核酸结合,插入碱基。浓度较高时,亚甲基蓝带
将 RNA 保存于甲酰胺中比储存于水中或乙醇中有更多好处:(1)甲酰胺将保护 RNA 不受 RNA 酶的降解,以这种方式保存的 RNA 是相当稳定的,可以在 4℃ 保存过夜,或在一 20
用磁性微球代转纤维索作为介质,这种方法比较常用且已商品化。
大多数哺乳动物的信使 RNA( mRNA) 都带冇 poly( A)+ 尾 ,使用本方案可以将带Poly ( A) +的 RNA 从总 RNA 中分离出來。
动物组织和细胞是分子生物学研究中最常用的实验材料,一个典型的哺乳动物细胞约含 105 ug RNA, 其中主要是 rRNA、tRNA 等核内小分子 RNA,以及少董的 mRNA。一般的实验只需
siRNA表达载体构建可应用于:(1)作为后基因组时代基因功能分析的有力工具;(2)基因组学、细胞信号传导通路分析;(3)药物靶点筛选、疾病治疗。
本实验来源「RNA 实验指导手册」主编:郑晓飞。
脱氧核酶是一类由三十几个脱氧核苷酸构成的寡聚脱氧核糖核苷酸,制备容易,使用方便,是体外在特定位点切割 RNA 的有效方法。常用于体外切割 RNA 底物的脱氧核酶是「10~23
核酶是获得长片段 RNA 特定位点切割产物的有用工具,可用于研究 RNA 修饰,修饰位点分析,以及获得具布不间长度末端的 RNA 转录产物。
T4RNA 连接酶已经用来生成很多位点特异修饰的 RNA,尤其是寡核苷酸修饰和用反义密码 tRNA 修饰的 RNA。另外,T4RNA 连接酶还可用于 RNA/DNA 分子内/分子间连接、甲链寡脱氧
T4 DNA 连接酶可将双链复合物缺刻连接,其中包括 RNA-DNA 杂合链及 RNA-RNA 杂合链。
利用 RNA 模板通过反转录获得 DNA,进而复制和感染细胞
转录过程中的 RNA 分子内标记,转录后利用 T4 多核苷酸激酶的 RNA5'端标记和利用 T4RNA 连接酶的 RNA3'端标记。
核转录 (runoff) 分析可以用于检测分离细胞核中特定基因的转录效率。进行核转录失控分析时,在体外将细胞核分离出来,然后在放射性同位素标记的核苷酸存在下进行转录,所合
在 2 个 5'端的核苷酸进行核糖基 C2'-甲氧基修饰。用修饰过的引物 PCR 扩增得到的 DNA 仍可降低 N+l 活性,由于 PCR 可以产生几个 kb 的长模板,因此可以制备少异质性的 R
一些 RNA 转录物要求其 5'末端有 m7 G(5')Ppp(5')G 帽子,它们在无细胞抽提物或在非洲爪蟾卵母细胞中才具有较高的翻译效率。也有报道表明具有甲基化帽子的转录物在体外
RNA 实验技术手册(分子克隆-实验指南系列)
利用 SDS 裂解细胞 ,并用酸性苯酚分级提取细胞总 RNA, 这是一种适合于处理 mRNA 含量相对较低、内源性 RNase 活性较髙的细胞的方法,该方法 RNA 损失极少,简便易行 ,可
大鼠肝经匀浆,离心取上清液,用苯酚、m-甲酚混合液提取 RNA。在萘 1,5-二磺酸的存在下,可使 rRNA 与 mRNA 等分离,得到纯 rRNA
从病理科取来的经福尔马林固定、石蜡包埋的组织可用于RNA 表达分析.常规固定和石蜡包埋后,从活组织、手术、尸体组织中分离出来的 RNA 并不完全降解.并且即使在切除后未立
全血中含有有核白细胞,因此从血液中抽提 RNA 比较方便,但是红细胞富含核糖核酸酶,所以从血液中分离 RNA 奋其持殊的难度。因此若能先将有核白细胞与红细胞分离开来,从血
在微酸的条件下,乙二醛的两个乙醛基与鸟苷的亚氨基相互作用形成环状化合物,抑制了链间 Watson-Crick 键的形成,使 RNA不能形成稳定的二级结构,它在琼脂糖凝胶电泳中的迁
琼脂糖凝胶电泳常用于 Northern 印迹前分离 RNA
采用分光光度法对核酸进行精确定量,因为这种方法不破坏结构,并且还能回收样品.。RNA 有吸收紫外光的性质,吸收高峰在 260nm 波长处,这是单个核糖核甘酸在 256nm 和 281n
用哺乳动物细胞 S10 抽提物翻译脊髓灰质炎病毒和丙型肝炎病毒 mRNA 的技术。
S30 提取物系列产品共分为三类:适用于对环状 DNA 进行体外翻译的大肠杆菌 S30 提取物系统、适用于对线状 DNA 进行体外翻译的大肠杆菌 S30 提取物系统和适用于对环状 DNA
非洲爪蟾卵母细胞体外翻译系统由于具有转移定位、信号肽的切除和糖篇化的能力,因此对于绝大多数的外源性 mRNA 都具冇持续性的修饰加工能力。由于其膜的稳定性高,因此可使
麦胚提取物体外翻译系统可用于病毒和真核细胞中 mRNA 在异种无细胞体系中的有效的翻译
从哺乳动物细胞中提取的 mRNA 或通过克隆化 DNA 在体外转录产生的 mRNA 在无细胞提取液中能被翻译而合成蛋白质,这些蛋白质可用于免疫沉淀试验或进行生物学活性测定。
体外实验有两种策略;一是将 包 含 Po ly( A) 位点目标基因的质粒与无细胞提取物共同孵育,以 使 RNA 聚 合 酶 II 转录目标基因,并对最初的转录进行加工;另一种策略是利
TNT 耦联网织红细胞裂解物系统乂可以分为:TNTT7 系统、TNTSP6 系统和 TN 下 PCR 系统。其屮,TNTT7 系统可以从线状和环状 DNA 中翻译蛋白质,SP6 系统只能使用环状 DNA 进
盐酸胍可在裂解细胞的同时快速抑制 RNA 酶的活性,本方法利用这特点来分离果蝇 RNA
可从酵母细胞提取质量良好的总 RNA.
通过 DEAE 纤维素柱纯化,除去少量 DNA、大分子 RNA、蛋白质、多糖等杂质,最后得到各种氨基酸专一性 tRNA 的混合物.
从各种不同的真菌中提取总RNA。
真核生物前体 mRNA ( pre-mRNA ) 的剪接分为两步,即先从前体切去内含子,然后将两个外显子连接在一起形成成熟的 mRNA。本实验来源「RNA 实验指导手册」主编:郑晓飞。
胞核提取物可以用于前体 mRNA 的剪接,S100 提取物中虽然包括许多剪接因子,但它不具有剪接活性,因为它只含有剪接所必需的部分 SR 蛋白,不过该提取物中补充一种或多种 SR
前体 mRNA ( pre-mRNA ) 剪接因子 SR(serine/argininc rich,富含丝/苏氨酸)蛋白家族是将剪接体组装到前体 mRNA 上的重要参与者。SR 蛋白是重要的剪接因子,该家族的不同
RNA 也可以由线状 DNA 为模板,通过 RNA 聚合酶(如T3、T7 或 SP6 ) 在体外合成。本实验来源「RNA 实验指导手册」主编:郑晓飞。
剪接体 ( spliccosome ) 是真核生物中从初级转录物中切除内含子的催化单位。剪接体包含 U1、U2、U4/U6、U5 snRNP 等 4 种小核糖核蛋白颗粒(snRNP ) 和大量的非 snRNP 蛋白
在细胞中表达的 RNA 除了我们所熟悉的 mRNA 以外,还有大量不编码蛋白质的非编码 RNA(noncoding RNA,ncRNA),非编码 RNA 在细胞中起着非常重要的作用,如 rRNA 和 tRNA
随机RNA文库的SELEX筛选实验可用于:(1)体外诊断;(2)体内治疗等。
单链DNA文库的SELEX筛选实验可用于:(1)体外诊断;(2)体内治疗等。
RNA 实验技术手册(分子克隆-实验指南系列)
从聚内烯酰胺凝胶中回收 RNA 片段最好的方法是粉碎浸泡法。此法能从变性胶屮很好的回收高纯度的单链 RNA。但是此法不适用于长转录产物,因为它既费时间效率又低,例如: 超
利用 DNA 聚合酶 I 的大片段(Klenow 酶)的 3'— 5'外切酶活性将 3'黏性末端转化成平末端。具体方法是在体外转录体系尚未加入核苷酸和 RNA 聚合酶时,加入 Klenoow 片
RNA 标准转录体系的一般回收率为 lugRNA/ug 质粒 DNA, 使用下面的方法,可以提高回收率至 5〜l0ug RNA/ug 质粒 DNA。大量制备 RNA 可以用于体外翻译。
PAT法 [ PCR poly(A) test ] 可以快速、灵敏地从总 RNA 中分析特异 mRNA,而且可以定量估算 RNA poly(A) 尾长度。这方法中,包括 cDNA 合成的整个操作过程都在一个反应管中
Fe(II)-EDTA 能够催化 RNA 或 DNA 的断裂,是 RNase 保护分析的一个补充方法,其优点是很少或没有碱基序列的特异性,其沿着整个长度的 RNA 或 DNA 链的剪切几乎是一致的
原位杂交(msituhybridization,ISH),也称作杂交组织化学或细胞学的杂交,是一种能够从形态学上证明特异性的 DNA 或 RNA 序列存在于制备的个别细胞、组织部分、单细胞或染
引物延伸法可用于 RNA 的作图和 RNA5'端的定暈。在此方法中,将过量的 5'端标记的单链 RNA 引物与待测的 RNA 杂交,随后用反转录酶延伸该引物,生成句 RNA 模板互补的 cD
SI 核酸酶是种内切酶,它是从米曲霉米曲霉 (Aspergillusoryzae) 中分离得到。它能降解单链核酸,却不能降解双链核酸。此外,它能高灵敏度地降解局部错配的双链分子,即使只
RNA 的斑点和狭缝杂交分析能够不经凝胶电泳就直接将 RNA 样品点在硝酸纤维素膜或尼龙膜上,然后与放射性标记的探针杂交,定性或半定量地测定 RNA。最初是由 Kafatos 等人用
氢氧化甲基汞和 RNA 中的尿嘧啶和鸟嘌呤上的亚胺键可发生反应,而这些键涉及到 Watson-Crick 碱基配对。因此,氢氧化甲基汞是一种有效的变性剂,能破坏 RNA 的二级结构.在
RNA 实验技术手册(分子克隆-实验指南系列)
RNA 实验技术手册(分子克隆-实验指南系列)
RNA 实验技术手册(分子克隆-实验指南系列)
光化学交联技术是研究核搪核蛋内复合物中 RNA 与蛋白的相互作用的有效手段。 其基本原理是未经任何化学修饰的 RNA -蛋白天然复合物在短波长紫外线(254 nm ) 照射时,RNA
细胞的环境、复制周期的状态和分化状态的改变会引起一些 mRNA 半衰期的改变。本实验来源「RNA 实验指导手册」主编:郑晓飞。
RNA 实验技术手册(分子克隆-实验指南系列)
RNA 实验技术手册(分子克隆-实验指南系列)
RNA 实验技术手册(分子克隆-实验指南系列)
利用硝酸纤维素滤膜结合可以测定蛋白与 DNA、RNA 间的结合,该方法的基础在于大多数蛋白可以与硝酸纤维素滤膜结合,如果蛋白质和核酸结合,那么该复合物也可以与硝酸纤维素
寡核苷酸靶向的 RNase Ⅱ 酶解实验是分析 RNA 蛋合复合物(RNP,核糖核蛋白颗粒)的方法,无论是对于粗提物还是提纯后的样品,对分析 RNP 的结构域的结构都非常有效。本实
本方法可从 100 只果蝇或约 2g 果蝇胚胎中制备 RNA。
聚丙烯酰胺共电泳(poiyacrylamide coelectrophuresis,PACE ) 检测是相对较晚发展起来的定量分析蛋白质、肽与 DNA 或 RNA 相互作用的方法。本实验来源「RNA 实验指导手册
酵母三杂交系统(yeast three-hybrid system)可用于分析蛋白质与 RNA 间的相互作用。在酵母三杂交系统中,RNA 蛋白质相互作用导致报道基因的转录,可以通过细胞生长、克隆
将 cDNA 文库表达的蛋白固定于硝酸纤维素膜或尼龙膜上,然后用标记的 RNA 对其进行筛选的方法是筛选 RNA 结合蛋白研究中最常用的技术。本实验来源「RNA 实验指导手册」主编
Northwestern 筛选蛋白表达文库的方法是通过构建 IPTG 可诱导的融合蛋白表达文库(融合蛋白的 N 端由载体序列编码,C 端由克隆到载体的 cDNA 文库编码),进而诱导融合蛋白
细胞中,蛋白质与 RNA 结合参与多种生理调控和发育过程。在 mRNA 的加帽,多聚腺苷酸化,剪切,核外运,翻译起始及降解等过程中都存在着蛋白质与 RNA 的直接相互作用。在发
RNA 足迹和修饰干扰分析(RNA footprinting and modification interference analysis)是用来研究 RNA 与蛋白质相互作用的技术。RNA 测序及其结构分析的原理是 RNA 足迹试
印迹杂交是指将待测核酸片段结合到一定的固相支持物上,然后与存在于液相中的标记探针进行杂交的过程。Northern 印迹技术(Northern blot)是分析 RNA 的一种方法,因与 So
大肠杆菌中异源性的 RNA-BP 与靶 RNA 的结合会抑制靶基因的翻译。此方法已成功地应用于包括 HIV Rcv 蛋白和核仁素(nucleolin)在内的多种 RNA-BP 的研究中。
基于补骨脂素光化学反应的 RNA-蛋白分子复合物分析法,能够在数据相对缺乏的情况下分析生理条件下的 RNA-蛋白复合物的拓扑构象。本实验来源「RNA 实验指导手册」主编:郑晓
一种通过筛选重组 cDNA 文库研究多肽与 RNA 相互作用的细菌抗转录终止检测系统。本实验来源「RNA 实验指导手册」主编:郑晓飞。
设计短发夹RNA
噬菌体展示技术是将外源基因与噬菌体的表面蛋白基因融合,在融合了外源基因的噬菌体颗粒的表面就会表达相应的外源蛋白,即外源基因编码的蛋白被展示在噬菌体颗粒的表面。本
凝胶阻滞实验(gel reiardadon assay,又称为 mobthty shift assay)方法简单、灵敏,可以定量的特性使它在研究转录和基因调控中广泛的应用。目前通常用于 RNA ( 或 DNA )
差异显示聚合酶链反应(PCR) 可促进在诸多物种中与污染暴露相关的新分子标志物的鉴定。至今,已有多种差异显示方法被详细描述。这里,我们描述了一种改良的RNA 随机引物触
转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing,PTGS)被称为RNA干扰(RNAi),与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链 RNA(dsRNA)导入细胞,可以使mRNA发
常与免疫学实验一起研究的技术。