RNA 标准转录体系的一般回收率为 lugRNA/ug 质粒 DNA, 使用下面的方法，可以提高回收率至 5〜l0ug RNA/ug 质粒 DNA。大量制备 RNA 可以用于体外翻译。

操作方法

RNA大量转录合成

材料与仪器

模板 DNA 或质粒
TE TE 饱和酚 氯仿 异内醇 3mol LNaAc 无水乙醇 5X 转录缓冲液 lOOmmoL LDTT RNasin rATP rGTP rUTP rCTP SF6 T3 或 T7RNA 聚合酶 异戊醇 DNase 7.5mol L 乙酸铵 无水乙醇 乙醇

步骤

一材料与设备

1) 模板 DNA 或质粒

2)TE

3)TE 饱和酚：氯仿

4) 氯仿：异内醇 (24:1)

5)3mol/LNaAc(pH5.2)

6) 无水乙醇

7)5X 转录缓冲液：200 mmol/LTris-HCl(pH7.9),30 mmol/LMgCl2，10 mmol/L 亚精胺,50 mmol/LNaCl

8)lOOmmoL/LDTT

9)RNasin

10)rATP，rGTP,rUTP,rCTP，各 2.5 mmoI/L

11)SF6,T3 或 T7RNA 聚合酶

12)TE-饱和的酚：氯仿：异戊醇 (25:24:1,PH4.5)

13)DNase

14)7.5mol/L 乙酸铵

15) 无水乙醇

16)70% 乙醇

二操作方法

1) 在室温条件下按顺序加入以下组分：

5X 转录缓冲液                                                      2ul

DTT，100 mmol/L                                                10ul

RNasin100U

rATP,rGTPT,rCTP,rUTP(各 2.5 mmol/L)                   20ul

线状模板 DNA(1〜2.5 mg/ml)                                2ul

SP6,T3 或 T7RNA 聚合酶                                     40U

加无 RNA 酶的水至终体积为                                l00ul

2) 于 37〜40℃ 反应 1 h

3) 按 RNA 标准转录反应所述的方法除去 DNA 模, 纯化 RNA 转录物。

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