肽图（Peptide Mapping）通过选择性裂解蛋白并对裂解产物进行分离与检测，以验证蛋白质一级结构的完整性、氨基酸序列正确性及潜在变异。本文给出两条常用路线：①胰蛋白酶裂解-反相HPLC（可联用MS）；②溴化氰（CNBr）裂解-SDS-PAGE/银染。

方法一：胰蛋白酶裂解—反相HPLC肽图

1.原理

在弱碱性环境下，胰蛋白酶特异切割赖氨酸（K）与精氨酸（R）残基的羧基端（后位若为脯氨酸通常不切），将蛋白分解为一组可重现的肽段；这些肽段在C8/C18反相色谱柱上按疏水性分离，以214 nm监测肽键吸收，获得具有“指纹”特征的肽图，通过与对照品肽图比对来评价一级结构的完整性与一致性。

2.试剂与材料

v酶与缓冲液:胰蛋白酶，现配0.1 mg/mL；1%(w/v)碳酸氢铵溶液，现配，调至pH 8.0±0.2

v色谱试剂：乙腈、TFA或甲酸

v其他：冰醋酸、纯水、0.22–0.45 μm滤膜、HPLC进样瓶

v色谱柱/HPLC：蛋白/肽专用C8/C18（150×2.1–4.6 mm，3–5 μm，300 Å），UV/DAD检测器

v样品：供试品与对照品各1.0 mg/mL，2–8°C保存，避免冻融

3.操作步骤

3.1.换液/脱盐

透析或超滤至1%(w/v)NH₄HCO₃。

3.2.酶切

加入胰酶按酶:底物=1:50(w/w)；37°C、16–24 h温和振荡消化。

3.3.终止反应与澄清

按体积比1:10加50%冰醋酸，10,000 rpm离心5 min或0.22–0.45 μm过滤取上清。

3.4.HPLC分离

v流动相：A=0.1%TFA-H2O；B=0.1%TFA-ACN

vMS联用：A/B改为0.1%甲酸体系，并完成等效验证

v柱温30°C（30±5°C）；流速1.0 mL/min（2.1 mm内径按截面积比例下调）

v梯度70 min：0→70%B（等价：A100%线性至30%）

v检测214 nm（可并采集280 nm提升鉴别力）

v进样体积：~100 μL/4.6 mm柱（小内径按柱体积同比例调整）

3.5.顺序与漂移监控

空白→对照品→供试品→对照品复测。

4.注意事项

v胰酶活性受pH、温度和盐度影响，消化期间尽量保持pH 8.0与恒温；

v样品中表面活性剂与高盐会抑制酶切与色谱分离，应提前脱盐换液；

vTFA可提升峰形但对MS不友好，如需联用MS可用0.1%甲酸替代并在方法验证中确认等效；

v大体积进样易致峰展宽，应结合柱内径优化进样量；

v系统适用性以对照品消化液评估保留时间RSD、关键峰分离度与尾峰因子。

5.常见问答

Q1：消化不完全怎么办？

A：延长酶切时间、提高酶:底物至1:25或轻微升温至40°C（需验证），并检查缓冲体系与去盐情况。

Q2：214 nm基线漂移较大？

A：确保流动相与样品基质匹配，充分脱气并稳定梯度；必要时降低TFA浓度或改用甲酸体系并重做系统适用性。

Q3：需要做MS确认吗？

A：肽图比对属表征方法，关键差异峰与重要标志肽建议以LC-MS/MS确认身份，提高结论可靠性。

方法二：溴化氰（CNBr）裂解—SDS-PAGE图谱

1.原理

溴化氰在强酸环境（通常70%甲酸）中特异裂解甲硫氨酸（M）残基的羧基端，生成具有可预测边界的大/中分子片段；这些片段经SDS-PAGE分离后以银染显色形成条带模式，通过与对照品比对可评估蛋白质一级结构的宏观一致性，尤其对含少数Met位点的蛋白有较强指纹识别力。

2.试剂与材料

vCNBr（剧毒、光敏，避光冷藏）

v甲酸（70–100%）

v纯水

vSDS-PAGE体系：推荐Tricine以提高小/中片段分辨率（16–20%分离胶或等效梯度胶）；大条带可用Tris-Gly12–15%

v显色：银染（高灵敏）或考马斯亮蓝（低背景）

v冻干机、电泳成像系统

v样品：供试品/对照品各取~50 μg蛋白；先以水透析16 h后冻干

3.操作步骤

3.1.准备

通风橱内、全程避光；佩戴合规PPE（耐化手套、护目镜、防酸围裙）。

3.2.裂解

向每份冻干样品加入CNBr裂解液（0.3 g CNBr/mL甲酸储备，按过量条件使用），每份加20 μL，室温避光24 h。

3.3.去除试剂

加入180 μL水稀释后再次冻干，以去除甲酸与残余CNBr。

3.4.复溶与电泳

以水或上样缓冲液复溶至合适浓度；按选定体系制胶，常规电泳，银染成像（或考马斯亮蓝）。

4.注意事项

v安全首位：CNBr可释放HCN/HBr，务必通风橱内、全程避光操作，佩戴耐化手套/护目镜/防酸围裙；废液按氰化物规范处置。

vMet位点依赖：Met过少时信息量有限，指纹性下降；必要时换用胰酶肽图或并行Glu-C等裂解。

v胶浓匹配：片段偏小用16–20%或梯度胶，偏大用12–15%；控制上样量避免拖尾。

5.常见问答

Q1：目标蛋白几乎没有Met，是否还能用CNBr法？

A：不推荐；可改用胰酶肽图或选择性内切酶（如Glu-C）获得信息量。

Q2：银染背景高怎么办？

A：缩短显色时间、更新试剂、严格清洁器皿；相对定量时可转用考马斯亮蓝以降低背景。

Q3：出现拖尾或条带发散？

A：检查复溶与变性条件、降低上样量、匹配胶浓或用梯度胶；必要时进行还原/烷基化减少聚集。

两种方法互补：胰酶-RP-HPLC肽图分辨率高、对局部差异敏感，适合精细一致性与降解体监测；CNBr-SDS-PAGE图谱边界清晰、流程简洁，适合含若干Met位点的快速结构核验。

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