产品简介

       Sulfo-Cyanine3 Maleimide （阿拉丁货号：S276245 ≥95% ；S595919 ≥96%）是一种硫醇反应性染料，用于标记巯基。常用于生物分子标记、荧光成像及其他荧光生物分析。Cy3染料在与蛋白质或其他生物分子（如肽、核酸）结合后，能够显著增强其荧光强度，从而用于高灵敏度的检测和标记。

• 中文名称：磺化Cy3-马来酰亚胺；水溶性Cy3-马来酰亚胺
• 英文名称：Sulfo-Cyanine3 Maleimide；Sulfo-Cy3 maleimide；Sulfo-Cyanine3 Maleimide
• CAS号：1656990-68-9
• 分子式：C36H41KN4O9S2
• 分子量：776.96
• Ex (nm)：555
• Em (nm)：569
• 纯度：95%+
• 规格：1mg、5mg、10mg、25mg
• 储存条件：-20℃，干燥，避光保存，避免频繁冻融，建议现配现用。
• 结构式：

产品优势

• 水溶性好
• 消光系数高
• 摩尔吸收率大
• 高特异性和灵敏度

实验方案

1. 溶液配制

（1）蛋白质储备溶液（溶液A）

将100µL反应缓冲液（例如pH~6.0的100mM MES缓冲液）与900µL蛋白溶液（例如抗体，蛋白质浓度>2 mg/mL）混合，制成1mL蛋白质标记储备溶液。

• 注意：蛋白质溶液（溶液A）的pH值应为6.5±0.5。
• 注意：不纯的抗体或用牛血清白蛋白（BSA）或其他蛋白稳定的抗体不能很好地被标记。
• 注意：蛋白质浓度低于2mg/mL，偶联效率会显著降低。为了获得好的标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为2-10mg/mL。

（2）染料储备溶液（溶液B）

将无水DMSO加入Cy3马来酰亚胺小瓶中，制成10mM储备溶液。通过移液或涡旋混合均匀。

• 注意：开始偶联之前准备染料储备溶液（溶液B）并及时使用。染料储备溶液长时间储存可能会降低染料活性。溶液B在避光和防潮的情况下可以在冰箱中储存4周。避免反复冻融。

（3）可选

如果您的蛋白质不含游离半胱氨酸，则必须用DTT或TCEP处理蛋白质生成硫醇基团。DTT或TCEP将二硫键转化为两个游离硫醇基团。如果使用DTT，则必须在马来酰亚胺染料与蛋白质结合之前，通过透析或凝胶过滤除去游离DTT。以下是生成游离硫醇基团的示例方案：

1. 在蒸馏水中制备1M DTT（15.4 mg/100 µL）的新鲜溶液。

2. 在20 mM DTT中制备IgG溶液：混合时每ml IgG溶液添加20 µL DTT储备液。在室温下静置30分钟，无需额外混合（以尽量减少半胱氨酸再氧化为胱氨酸）。

3. 将还原的IgG通过用“交换缓冲液”预平衡的过滤柱。从柱中收集0.25 mL馏分。

4. 确定蛋白质浓度并将大部分IgG的组分合并。可以通过分光光度法或比色法来完成。

• 注意：为了获得好的结果，IgG溶液的浓度应>4 mg/mL。如果抗体低于2 mg/mL，则应进行浓缩。另外，需要增加10%来补偿在缓冲液交换柱上的损失。
• 注意：还原反应可以在pH 7-7.5的任何缓冲液中进行，例如MES、磷酸盐或TRIS缓冲液。
• 注意：步骤3和4可以用透析代替。

2. 样品实验方案

（该方案适用于山羊抗小鼠IgG与Cy3马来酰亚胺的偶联物标记。）

• 注意：每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比，这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能会对其结合亲和力产生不利影响，而低染料/蛋白质比的蛋白质偶联物会降低灵敏度。

（1）进行偶联反应

1. 使用10:1的摩尔比率（溶液B（染料）/A（蛋白质））作为起点：将5µL染料储备溶液（溶液B，假设染料储备溶液为10 mM）加入蛋白质溶液（95µL溶液A）的小瓶中并充分摇晃。假设蛋白质浓度为10mg/mL，蛋白质分子量为~200KD，则蛋白质浓度为~0.05 mM。

• 注意：建议使用溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的摩尔比为10:1。如果太少或太高，可以尝试5:1、15:1和20:1来确定合适的染料/蛋白质比。

2. 在室温下继续旋转或摇动反应混合物30-60分钟。

（2）纯化偶联

（以下方案是使用Sephadex G-25柱纯化染料蛋白偶联物的一个例子）

1. 按照产品说明准备Sephadex G-25柱。

2. 将“进行偶联反应”步骤中的反应混合物装入Sephadex G-25柱的顶部。

3. 当样品刚低于顶部树脂表面时，立即加入PBS（pH 7.2-7.4）。

4. 向样品中加入更多的PBS（pH 7.2-7.4）完成柱子纯化。将含有目标染料-蛋白质缀合物的组分合并。

• 注意：如果需要立即使用，染料-蛋白质缀合物物需要用染色缓冲液稀释，并分装。
• 注意：为了长期储存，染料蛋白缀合物溶液需要浓缩或冷冻干燥。

阿拉丁化学品清单

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