本试剂盒采用独特的玻璃纤维素膜吸附技术，高效专一地结合质粒 DNA。同时采用精心优化的 Buffer P4 和过滤器 GS2，可有效的去除内毒素、蛋白等杂质；整个提取过程仅 需 1 h，方便快捷。使用本试剂盒提取的质粒 DNA 可适用于各种常规操作，包括酶切、 PCR、测序、连接、转化和转染多种细胞等实验。 推荐每次菌液使用量：高拷贝质粒推荐使用量为 100 ml，得率一般在 500-1500 μg 左 右；低拷贝质粒推荐使用量为 200 ml，得率一般在 200-600 μg 左右。
产品组分表
| E778409 | Component | 10 T | Storage | | E778409A | Buffer BL | 30 ml | RT | | E778409B | Buffer P1 | 100 ml | RT | | E778409C | Buffer P2 | 100 ml | RT | | E778409D | Buffer P4 | 100 ml | RT | | E778409E | Buffer DW2 | 44 ml | RT | | E778409F | Buffer EB | 30 ml | RT | | E778409G | RNase A (10 mg/ml) | 1 ml | RT | | E778409H | 收集管（50ml） | 10 个 | RT | | E778409I | 吸附柱AFT(含50ml收集管) | 10 个 | RT | | E778409J | 过滤器GS2 | 10 个 | RT |
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注意事项
1. 在使用前将全部RNase A加入Buffer P1，混匀，置于2-8℃保存。
2. 使用前先检查Buffer P2是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀现象，可在50℃水浴 中加热几分钟，即可恢复澄清。
3. 注意皮肤不能直接接触Buffer P2和Buffer P4，使用后应立即盖紧盖子。
4. 提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或 大于10 kb的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加P1、P2和P4的用量；洗脱缓 冲液推荐在65-70℃水浴中预热 (可以适当延长吸附和洗脱时间，以提高提取效率)。
5. 实验前使用Buffer BL处理吸附柱，可以最大限度激活玻璃纤维素膜，提高得率，处理过的柱子最好立即使用，放置时间过长会影响使用效果。
操作步骤
使用前，向44mL Buffer DW2中加入176mL 无水乙醇。
1. 柱平衡步骤：向吸附柱 AFT 中 (吸附柱放入 50 ml 收集管中) 加入 2.5 ml Buffer BL，8,000 rpm (～8,228×g)离心2 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。(用平 衡液处理过的柱子最好立即使用)。
2. 取100 ml（根据培养菌体的浓度选择合适的量，低拷贝推荐用 200 ml）过夜培养的菌液加 入离心管，室温 8,000 rpm (～8,228×g)离心3 min 收集细菌，尽量吸除上清。
注意：菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中，菌液量以能够充分裂解为佳，菌液过多会导致裂解不充分从而降低质粒的提取效率。
3. 尽量吸除上清，为确保上清液全部吸取，请用干净的吸水纸吸去瓶壁上的水滴。
4. 向留有菌体沉淀的离心管中加入 8 ml Buffer P1 (请先检查是否已加入 RNase A)，使用涡 旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
注意：请务必彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解效果，导致提取量和纯度偏低。 对于低拷贝质粒，加大菌体用量的同时按比例增加 P1、P2 和 P4 的用量。
5. 向离心管中加入 8 ml Buffer P2，立即温和地上下翻转 8 次，使菌体充分裂解，室温放置5 min。
注意：温和地混匀，每次旋转 180 度后停留 1-2 sec 以使其充分混匀，不要剧烈震荡，以免污染基因组 DNA。此时菌液应变得清亮粘稠，如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
6. 向离心管中加入 8 ml Buffer P4，立即温和地上下翻转 8 次，充分混匀，至溶液出现白色分 散絮状沉淀，然后室温放置 10 min 左右。8,000 rpm (～8,228×g)离心 5 min，将上清小心 倒入过滤器 GS2 中，慢慢推动推柄过滤，滤液收集在干净的带刻度的 50 ml 离心管中（需自备）。
7. 向滤液中加入 0.3 倍滤液体积的异丙醇 (加入异丙醇过多容易导致 RNA 污染)，上下颠倒混 匀后转移到吸附柱 AFT 中 (吸附柱放入 50 ml 收集管中)。
注意：过滤后滤液会损失，根据损失的不同请加入不同体积的异丙醇。建议加入溶液的体积为不超过 10 ml(超过该体积可能会导致液体溅出)，对于 100 ml 菌体，需要分 3 次过柱。
8. 8,000 rpm (～8,228×g)离心 2 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
注意：对于 100 ml 菌体，第 7 步中所得溶液需要分 3 次过柱，离心均按照步骤 8 进行。
9. 向吸附柱中加入 10 ml Buffer DW2 (请检查是否已加入无水乙醇)，8,000 rpm(～8,228×g)离心 2 min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
10. 重复操作步骤 9。
11. 8,000 rpm (～8,228×g)离心 5min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
12. 将吸附柱置于一个干净的 50 ml 收集管中，向吸附膜中间部位悬空滴加 1-2 ml Buffer EB (Buffer EB 需在 65-70℃水浴中预热 3-5 min)，室温放置 5 min，然后室温8,000 rpm (～ 8,228×g)离心2 min。将50 ml 离心管中洗脱液全部转入一个干净的 1.5 ml 离心管，-20℃ 保存。
注意：为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤 12。洗脱液的 pH 值 对于洗脱效率有很大影响。若用 ddH2O 做洗脱液应保证其 pH 值 7.5-8.0 范围内，pH 值低于 7.0 会降低 洗脱效率。洗脱缓冲液用量的多少主要是依据质粒的拷贝数以及实验所需要的浓度来确定。建议洗脱缓冲 液体积为 2 ml，如果需要更高浓度质粒或提取低拷贝质粒，可使用 1 ml，体积过小影响回收效率。 DNA 产物应保存在-20℃，以防降解。
可选步骤（如果需要更高浓度的质粒，可进行如下操作）
1. 每1 ml 洗脱液加入 1.42 ml 异丙醇以及 0.42 ml 5M NaCl（客户自备），混匀，室温放置 5 min，8,000 rpm 离心10 min，小心弃上清。
2. 加入0.5 ml 的70%乙醇洗涤沉淀，室温8,000 rpm 离心5 min，小心弃乙醇。
3. 重复操作步骤 2。
4. 空气中干燥沉淀约 5-10 min，根据需要用适当体积的 Buffer EB 溶解沉淀。
质粒 DNA 浓度及纯度检测
得到的质粒 DNA 可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260 值为 1 相当于大约 50 μg/ml 双链DNA。纯化的质粒 DNA OD260/OD280通常在 1.7-1.9 左右，可直接应用于细胞转染甚至动物体内实验等对 DNA 纯度要求很高的实验中。
危险品化学品经营许可证（带存储）