纳米抗体具有分子量小、表位可及性高和工程化灵活等特点，可用于肿瘤分子成像、靶向递送、免疫调控及工程化细胞治疗。

        关键词：纳米抗体；VHH；重链抗体；多价化；多特异性；肿瘤成像；靶向治疗；药物递送；免疫治疗；抗体文库

1 纳米抗体的来源、结构与分子特征

1.1 纳米抗体的生物学来源

        纳米抗体通常指骆驼科动物重链抗体的可变结构域（variable domain of heavy-chain-only antibody，VHH）。骆驼科重链抗体天然缺少轻链和重链CH1结构域，单个VHH即可独立完成抗原识别，分子量通常约为12～15 kDa。鲨鱼新抗原受体抗体的可变结构域VNAR也属于单域抗体，但其进化来源、结构组成和抗原结合方式与VHH不同，肿瘤研究中所称的纳米抗体通常主要指VHH。

1.2 VHH的结构组成

        VHH保留典型免疫球蛋白折叠，由框架区和三个互补决定区组成。

（1）框架区

        VHH原本与轻链接触的部分框架残基具有较强亲水性，可降低缺少轻链后疏水表面暴露造成的聚集，并支持单个结构域独立折叠。

（2）CDR1和CDR2

        参与抗原表面的初始识别和结合界面形成，其序列及空间构象会影响VHH的特异性和亲和力。

（3）CDR3

        通常比传统抗体重链可变区的CDR3更长，可进入酶活性口袋、受体沟槽和其他空间受限表位；部分VHH还含有连接CDR3与CDR1或框架区的额外二硫键，有助于稳定抗原结合构象。

1.3 纳米抗体的主要分子特征

（1）分子尺寸较小

        较小的水动力学半径有利于组织扩散和隐蔽表位识别，也会增加肾小球滤过和快速清除。

（2）表达与工程化相对简便

        VHH不需要重链和轻链配对，可在细菌、酵母或哺乳动物细胞中表达，并便于进行串联、融合、定点突变和化学偶联。

（3）稳定性具有克隆差异

        部分VHH具有较好的热稳定性、溶解性和复性能力，但不同克隆的聚集倾向、冻融稳定性及制剂耐受性差异明显，仍需逐一验证。

（4）天然缺少Fc功能

        单个VHH不能天然介导Fcγ受体结合、补体激活和FcRn回收，因此不具备完整IgG的长循环及Fc效应，需要根据用途进行功能补充。

2 纳米抗体与传统单克隆抗体的性能差异

3 纳米抗体的多价化、多特异性与功能偶联设计

        纳米抗体工程化的核心是根据靶点分布、作用机制和预期体内暴露，对结合价态、靶点数量、半衰期和功能载荷进行组合设计。

（1）多价化设计

        将两个或多个相同VHH串联可提高表观结合强度和受体占据率，并增强对高密度抗原细胞的选择性。多价结合也可能诱导受体聚集、内化或异常激活，因此需结合靶点功能评价具体构型。

（2）多表位设计

        将识别同一靶点不同表位的VHH组合，可减少单一表位遮挡或突变造成的逃逸，并可能增强受体阻断和内化。

（3）多特异性设计

        将不同肿瘤抗原识别模块组合可扩大对肿瘤异质性的覆盖范围；将肿瘤抗原VHH与CD3、CD16或免疫检查点结合模块连接，则可募集T细胞、NK细胞或将免疫调节作用集中于肿瘤局部。

（4）半衰期延长设计

        白蛋白结合VHH、Fc融合或其他增大水动力学半径的结构可降低肾清除并延长循环时间。成像探针通常需要快速降低血液背景，而持续治疗分子需要较长受体占据，因此二者的药代设计不同。

（5）功能偶联设计

        纳米抗体可与荧光染料、放射性核素、细胞毒药物、蛋白毒素、光敏剂或纳米载体连接。定点偶联有助于控制修饰位置和载荷数量，减少随机标记对抗原结合界面的干扰。

4 纳米抗体在肿瘤分子成像与诊断中的应用

4.1 肿瘤分子成像

（1）PET与SPECT成像

        纳米抗体可连接正电子或单光子发射核素，用于检测肿瘤抗原表达、病灶分布和病灶间异质性。核素半衰期应与纳米抗体快速分布和清除的特点匹配，以减少未结合探针和肾脏摄取造成的非靶组织辐射。

（2）荧光成像

        荧光标记纳米抗体可用于细胞成像、组织切片、多重标志物分析和术中导航。近红外染料具有较低组织自发荧光，更适合体内肿瘤边界识别。

（3）多模态成像

        将放射性和荧光标记整合于同一纳米抗体，可结合术前全身定位与术中局部导航，但双重修饰需避免影响结合活性和体内分布。

4.2 病理检测与体液标志物分析

        纳米抗体尺寸小、表位可及性较好，可作为免疫组化、免疫荧光和生物传感器中的识别分子，尤其适合检测空间受限或容易被传统抗体遮挡的表位。将VHH固定于电化学、光学或微流控平台，还可用于检测体液中的肿瘤抗原、外泌体和其他标志物；检测性能除取决于亲和力外，还受到固定方向、表面密度、样本基质和抗原构象影响。

4.3 成像与诊断结果判读

        肿瘤中的高探针摄取可能来源于特异性结合，也可能受到血管通透性、局部血流和非特异性滞留影响。成像研究应联合评价肿瘤摄取值、肿瘤与血液比值、肿瘤与肌肉比值、主要器官分布和时间变化，并设置非结合VHH、靶点阴性模型及竞争阻断组；荧光或放射性信号增强不能直接等同于靶点表达升高，仍需通过组织学或蛋白检测确认。

5 纳米抗体在肿瘤靶向治疗与药物递送中的应用

5.1 肿瘤靶向治疗方式

（1）受体和配体阻断

        纳米抗体可结合肿瘤细胞表面受体、配体或酶活性区域，阻断配体结合、受体二聚化和下游信号。单价VHH持续时间较短时，可通过多价化、双表位结合或半衰期延长提高阻断能力。

（2）纳米抗体-药物偶联物

        VHH可将细胞毒药物递送至肿瘤细胞。适合的靶点应在肿瘤中高表达、在关键正常组织中表达较低，并在结合后发生内化；连接子还需在循环中稳定，并在内体、溶酶体或胞质环境中释放载荷。

（3）纳米抗体-毒素融合物

        将VHH与蛋白毒素或毒素催化结构域融合，可利用靶点介导的内吞杀伤肿瘤细胞。此类分子的效力较高，但正常组织低水平靶点表达和非特异性摄取也可能造成明显毒性。

（4）放射性核素靶向治疗

        治疗性α或β核素可通过纳米抗体递送至肿瘤组织，利用辐射杀伤靶细胞和邻近细胞。肾脏重吸收和放射性代谢物滞留是重要限制。

（5）纳米载体靶向递送

        纳米抗体可修饰脂质体、聚合物颗粒或其他载体，用于递送化疗药、核酸和光敏剂。载体整体粒径、表面电荷和蛋白冠会重新决定体内分布，因此游离VHH的高渗透性不能直接外推至大型载体。

5.2 靶向递送的关键评价因素

        药物递送效果需同时考虑靶点表达、内化速度、胞内运输、连接子稳定性、载荷释放和正常组织摄取。仅观察到纳米抗体与细胞表面结合，不能证明载荷能够进入适宜的胞内区室；仅有体外杀伤结果，也不能替代对血清稳定性、游离载荷和主要器官分布的评价。

6 纳米抗体在肿瘤免疫调控与细胞治疗中的作用

6.1 肿瘤免疫调控方式

（1）免疫检查点阻断

        纳米抗体可阻断肿瘤细胞和免疫细胞之间的抑制性受体-配体相互作用，也可与肿瘤抗原识别模块组合，提高免疫调节分子在肿瘤局部的浓度。

（2）T细胞募集

        肿瘤抗原VHH与CD3结合模块连接后，可同时结合肿瘤细胞和T细胞，诱导免疫突触形成和靶细胞杀伤。

（3）NK细胞募集

        肿瘤靶向VHH与CD16或其他NK细胞受体结合模块组合，可促进NK细胞接近并杀伤肿瘤细胞。

（4）肿瘤微环境调控

        纳米抗体可靶向免疫抑制性细胞因子、趋化因子、髓系细胞或异常基质成分，改变免疫细胞浸润和局部免疫抑制状态。

图1 纳米抗体在肿瘤靶向治疗、药物递送与免疫微环境调控中的应用示意图

6.2 纳米抗体在工程化细胞中的应用

        VHH可替代传统单链抗体可变片段作为CAR-T或CAR-NK的胞外识别结构域，其结构简单、链间错配风险较低，便于构建双靶点和多靶点CAR。VHH还可在细胞内表达为胞内纳米抗体，干预致癌蛋白、融合蛋白或信号复合物，并可与蛋白降解模块连接以降低靶蛋白水平。

        纳米抗体在游离状态下具有较高结合能力，并不代表其在CAR或多特异性构型中一定具有理想功能。表位位置、铰链长度、跨膜区、共刺激结构域和免疫突触几何结构均会影响最终活性；过强或持续的效应细胞激活还可能引起细胞因子释放、耗竭和正常组织损伤。

7 纳米抗体文库构建、筛选与制备技术

7.1 纳米抗体文库类型

（1）免疫文库

        来源于经目标抗原免疫的骆驼科动物，通常较容易获得经过体内亲和成熟的特异性克隆，但需要动物免疫周期。

（2）天然文库

        来源于未经特定抗原免疫的个体，可用于多种靶点筛选，但通常需要较大的有效库容量。

（3）合成与半合成文库

        以稳定VHH框架为基础人工设计CDR多样性，可减少动物依赖并提高序列可控性，其性能取决于框架选择、氨基酸分布和实际功能多样性。

7.2 纳米抗体筛选方法

（1）噬菌体展示

        通过多轮抗原吸附、洗涤和扩增富集结合克隆，技术成熟且适用于大规模文库。

（2）酵母展示

        可结合流式细胞分选，同时评价VHH表面表达量和抗原结合能力。

（3）核糖体展示与mRNA展示

        不受细胞转化效率限制，可建立更大规模的体外文库，但后续克隆表达和功能验证要求较高。

（4）细胞筛选

        针对膜受体时，可使用靶点阳性细胞进行筛选，并使用靶点阴性细胞扣除非特异性克隆，以提高对天然构象表位的识别能力。

7.3 亲和成熟、人源化与制备

        亲和成熟可通过CDR定点突变、易错PCR和二级文库筛选提高结合能力，但应同步评价特异性、解离速率、表达量和聚集风险。人源化主要通过调整VHH框架残基降低潜在免疫原性，同时保留维持独立折叠和CDR构象的关键位点；过度替换可能降低稳定性和亲和力，需要通过回复突变和实验验证进行修正。

        纳米抗体可在细菌、酵母或哺乳动物细胞中表达。制备后需检测纯度、单体比例、分子量、聚集、内毒素、结合亲和力和生物学活性；多价、融合或偶联分子还需评价结构完整性、标记效率、血清稳定性及改造后的结合能力。

8 纳米抗体临床转化的药代动力学、安全性与技术挑战

        纳米抗体临床转化需要同时解决体内暴露、安全性、靶点选择和生产一致性问题。

（1）快速清除与肾脏摄取

        单价VHH通常快速经肾小球滤过，并可能在近端肾小管中重吸收。快速清除适合成像，但会降低治疗性分子的持续暴露，并增加放射性或毒性载荷的肾脏蓄积。

（2）免疫原性

        非人源框架、CDR、人工连接肽和新形成的结构界面均可能诱导抗药抗体。人源化可降低部分风险，但不能完全消除免疫原性。

（3）正常组织毒性

        高亲和力、多价化和细胞毒载荷会放大正常组织低水平靶点表达造成的损伤，因此需综合评价肿瘤表达比例、正常组织分布、可溶性抗原和靶点内化。

（4）肿瘤异质性与抗原逃逸

        单一靶点可能无法覆盖全部肿瘤细胞，双靶点或多靶点设计可降低逃逸风险，但会增加正常组织交叉结合和作用机制分析的复杂度。

（5）分子稳定性与聚集

        多价化、Fc融合和疏水载荷偶联可能增加聚集、降解和表达量下降，需要建立能够区分单体、聚集体、降解产物和不同偶联形式的质量控制体系。

（6）剂量与作用机制验证

        临床剂量不能仅由体外亲和力推算，还需结合药代动力学、组织分布、受体占据和药效标志物，区分暴露不足、靶点不依赖和下游耐药等不同原因。

9 纳米抗体研究相关产品

        纳米抗体的优势不仅在于分子尺寸小，更在于可围绕靶点特征和作用机制进行多价化、多特异性、半衰期和功能载荷设计。只有将靶点选择、体内分布、结合与功能活性、制备质量和安全性联合评价，才能将其结构优势转化为可靠的肿瘤诊断与治疗效果。

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