计算溶液所需的质量、体积或浓度。
BioReagent 级 ,适用于对基线干扰要求严格的色谱和分析工作流程。
2-8°C储存,禁止冷冻。低温运输,禁止冷冻 。请查阅批次 COA 获取详细规格。
SDS、COA、产品数据表及规格说明书均可下载。可通过批号查询获取批次 COA。
在色谱分析、有机合成和交叉偶联反应领域已被 0 篇同行评审文献引用。
储存缓冲液:20 mM PBS, 5% BSA
Flag纳米抗体磁珠偶联了经过严格筛选、优化并重组表达的Flag纳米抗体,可用于捕获哺乳动物、植物、细菌、酵母、昆虫等多种生物细胞、组织提取物中的Flag标签(DYKDDDDK)融合蛋白及其相互作用蛋白。
实验前先将Flag标签与目标蛋白在细胞或组织中融合表达;之后将Flag纳米抗体磁珠加入样本裂解液中,Flag纳米抗体与目标融合蛋白及其结合蛋白形成复合体;去除未结合的蛋白后,可以采用多种方法洗脱蛋白质,并且IP洗脱液中不会有抗体轻、重链污染。
产品特性:
| 磁珠直径 | 2 µm |
| 蛋白结合量 | ≥1.5 mg 蛋白/mL磁珠 |
| 反应性 | 可特异性结合1×或3×Flag标签(DYKDDDDK),对融合蛋白N端、C端或中间的Flag标签均可以识别 |
| 应用 | 免疫沉淀(IP)、免疫共沉淀(Co-IP)、染色质免疫沉淀(CHIP)、RNA 结合蛋白免疫沉淀(RIP) |
| 储存缓冲液 | 20 mM PBS, 5% BSA |
| 储存条件 | 4℃. Do not freeze. 有效期1年 |
产品优势:
1、纳米抗体,无轻重链污染。IP复合物无论采用非变性洗脱还是变性洗脱均不会出现抗体的轻、重链污染问题。
2、亲和力强。低nM级别亲和力,轻松应对低拷贝基因,或难转染细胞系。
3、结合量高。采用定向偶联技术每10 μL抗体磁珠可结合约15 μg重组蛋白。
4、特异性强。抗体磁珠通过了10株以上的空白细胞系检测不易产生非特异吸附。
5、兼容性好。无论标签在诱饵蛋白的N端或C端都可识别。
6、稳定性好。通过了40℃高温测试轻松应对物流失温,实验后忘记放冰箱等情况。
使用说明:
一、所需主要仪器
磁力架、混匀仪、低温离心机、超声破碎仪。
二、建议的缓冲液配方
| 缓冲液 | 配方 |
| 裂解缓冲液 | 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 0.5 % NP-40(在4°C下调整pH) |
| 漂洗缓冲液 | 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 0.05 % NP-40(在4°C下调整pH) |
| 洗脱缓冲液 | 3×Flag多肽用PBS溶解成400 ng/µL |
| 2×SDS-PAGE上样缓冲液 | 125 mM Tris-HCl pH 6.8, 4% SDS, 20%甘油, 0.004%溴酚蓝 |
三、注意事项
1、请勿干燥、冷冻或剧烈涡旋磁珠,禁止长时间置于磁场,可能会引起磁珠聚团,降低结合活性。
2、为保证磁珠均匀分布,请通过反复颠倒、轻微涡旋彻底混匀瓶中磁珠。
3、请勿使用PBS漂洗磁珠,否则会导致磁珠无法被磁力架吸附。
4、实验前应在裂解缓冲液和漂洗缓冲液中加入足量的蛋白酶抑制剂,RIP实验还应添加足量的RNase抑制剂,混合均匀,冰上保存,现配现用。
5、IP实验前,应先确认样本裂解液(input)中诱饵蛋白的表达水平。
6、IP实验应设置阴性对照组,通常采用表达Flag标签空载体的样本作为对照。
7、如果使用建议的缓冲体系不能获得很好的实验结果,可自行筛选、配制缓冲液进行实验。
8、具体样品量和孵育时间依赖于每个特定体系,可能需要优化才能得到最大产量。
9、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
10、本产品仅限于科学研究使用,不得用于临床诊断或治疗。
四、操作步骤
1、样本裂解(参考)
(1) 按如下方法收集样本:
| 样本类型 | 样本量/组 | 收集方法 |
| 动物细胞 | 1×10⁷个 | 冷PBS漂洗2~3次,每次4℃ 500g 离心5min收集沉淀,尽量吸干液体 |
| 动物组织 | 100~200 mg | 冷PBS或生理盐水清洗干净,彻底去除血液等成分,液氮充分研磨 |
| 植物组织 | 200~300 mg | 无菌双蒸水清洗干净,液氮充分研磨 |
| 革兰氏阴性细菌 | 50μL 菌体沉淀 | 冷PBS漂洗2~3次,每次4℃ 5000 g离心5 min收集沉淀,尽量吸干液体 |
(2) 将样本置于冰上,每组样本加入500 μL预冷的裂解缓冲液,吹打混匀。
(3)
a. 动物细胞:最好冰上超声至溶液基本澄清;如果无超声条件,可以置于冰上裂解30min,间隔手动混匀。
b. 动物组织、植物组织、微生物:冰上超声破碎至溶液基本澄清。
(4) 4℃ 12000 g 离心 15 min,收集上清至新的离心管中,取30 μL作为input,剩余置于冰上备用或 -80℃保存。
【注意】:
i. 当样本不能完全裂解时(溶液很浑浊),可以增加裂解缓冲液、改善裂解方法或改善超声条件继续裂解,超声条件因样本类型和超声设备而异,应提前摸索好合适的条件。
ii. 裂解缓冲液用量可随样本量增加而等比例增加,但总孵育体积最大不超过离心管体积的2/3,体积过大可以更换大规格离心管。
2、免疫共沉淀
(1) 将Flag纳米抗体磁珠上下颠倒混匀,每组取20~30 μL磁珠到新的离心管中。
(2) 加入200 µL漂洗缓冲液,颠倒混匀30次,放磁力架上静置1 min并弃上清。
(3) 重复上步操作一次。
(4) 向磁珠中加入相应组别的样本裂解液,放混匀仪上室温孵育1~2 h或4℃孵育过夜。
(5) 放磁力架上静置1 min并弃上清。
(6) 加入500 μL漂洗缓冲液,颠倒混匀30次,放磁力架上静置1 min并弃上清。
(7) 重复上步操作两次,共漂洗三次。
3、洗脱
(1) SDS-PAGE 上样缓冲液洗脱(变性洗脱法):加入50 μL 1×SDS-PAGE上样缓冲液,95℃加热5~10min。放磁力架上静置1min或5000 g离心1min,收集上清至新的离心管中。洗脱后的蛋白 -20℃保存,或直接用 于SDS-PAGE和Western Blot实验,SDS-PAGE胶条可以用于质谱检测。
(2) 3×Flag肽竞争洗脱(非变性洗脱法):加入40~50 µL Flag 多肽洗脱液 (400 ng/µL),涡旋震荡 20s,放混 匀仪上室温洗脱10~15min,涡旋震荡20s;1000 g离心20s,放磁力架上静置1min,收集上清至新的离心管中。洗脱后的蛋白 -80℃保存,或直接用于SDS-PAGE、Western Blot和质谱等实验。
【备注: Anti-Flag 纳米抗体磁珠没有抗体轻重链污染问题,建议首选变性洗脱法,洗脱效率更高。】
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| 批号(Lot Number) | 证书类型 | 货号 |
|---|---|---|
| 分析证书 | F1373479 | |
| 分析证书 | F1373479 | |
| 分析证书 | F1373479 | |
| 分析证书 | F1373479 | |
| 分析证书 | F1373479 | |
| 分析证书 | F1373479 |