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蛋白纯化中的分离介质选择：凝胶填料与磁珠的原理与应用

· · 发布于 2025年12月24日 · 更新于 2025年12月24日 ·

蛋白纯化流程中，层析填料与磁珠是实现“选择性结合—洗脱”的核心分离介质。不同基质（琼脂糖、葡聚糖、合成聚合物等）及不同功能化方式（离子交换、亲和、疏水、分子筛等），决定了介质在载量、分辨率、耐压性与生物相容性等方面的性能差异。与此同时，以Fe₃O₄/Fe₂O₃为磁性核心、外包覆多种基质和活性基团的功能化磁珠，进一步在小体积、高通量和自动化场景下拓展了蛋白纯化手段。本文围绕凝胶填料与磁珠的结构特点、分类方式及与纯化阶段的匹配关系，对分离介质的选择与组合策略进行系统梳理，为蛋白纯化工艺设计提供参考。

一、蛋白纯化分离介质的基本概念

1.1层析填料与磁珠在纯化中的角色

（1）层析填料与磁珠是蛋白纯化中实现选择性吸附、洗脱和分离的核心载体，其本质是“带有特定孔结构和化学功能基团的固相”。

（2）传统层析更多依赖固定在色谱柱内的凝胶填料，通过泵及压力系统完成上样与洗脱；磁珠则依靠外加磁场实现固液分离，适用于小体积、批处理和自动化平台。

（3）无论凝胶填料还是磁珠，均可通过更换基质和功能基团，构建离子交换、亲和、疏水作用、凝胶过滤、反相等不同分离模式。

1.2分离介质设计的三大要素

（1）基质（matrix）：决定机械强度、耐压性能、生物相容性以及表面化学修饰的灵活度，如琼脂糖、葡聚糖、多孔聚合物等。

（2）孔结构（pore structure）：包括孔径大小、孔径分布和比表面积，决定目标蛋白能否进入微孔以及有效接触到功能基团。

（3）功能基团（ligand）：通过离子键、配位键、生物识别或疏水相互作用选择性结合目标蛋白，是决定“选择性”的关键因素。

二、凝胶填料：基质类型与结构特征

2.1凝胶填料的定义与常见基质

（1）琼脂糖基质填料

为使用最广泛的亲水性多糖基质之一，可通过交联和化学修饰制备亲和层析、离子交换层析、疏水层析等多类型填料。其优点包括：良好生物相容性、低非特异吸附、易于化学衍生化。

（2）葡聚糖基质填料

以葡聚糖为骨架，常被制备为不同孔径的分子筛层析（凝胶过滤）填料，用于按分子大小实现分离，适合作为精制阶段的高分辨率纯化工具。

（3）合成聚合物基质填料

以交联聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯等为代表，具有较高的机械强度和耐压性能，适用于高流速与放大生产，可制备为离子交换、疏水层析、亲和层析等多种类型。

2.2优质凝胶填料的理化指标

（1）形貌与粒径分布

高质量填料通常表现为外形规整的球形颗粒，粒径均一、分布窄，几乎不含破损或畸形微球，有利于获得稳定的柱效和压力行为。

（2）孔结构与化学稳定性

颗粒内部和表面的孔结构应连续且可被蛋白有效进入；交联度与表面接枝密度需在“机械强度”与“蛋白可达性”之间取得平衡，兼顾高载量与良好流动特性。

2.3琼脂糖基质凝胶的结构优势

（1）完整光滑的球形颗粒

琼脂糖基质经过优化成球工艺可形成表面光滑、粒径均一的微球，有利于装柱致密、减少死体积与涡流扩散，提升分辨率。

（2）表面多孔结构

微球表面及内部存在互通孔道，允许蛋白分子进入颗粒内部与功能基团接触，从而增加有效结合面积，提高静态和动态载量。

（3）交错接枝与高密度配体

通过在琼脂糖骨架上进行交联和接枝，可在保持亲水性的同时引入高密度功能基团（离子交换基团、亲和配体等），实现更高的结合容量和选择性。

三、磁珠：结构组成与类型

3.1磁珠的基本结构

（1）磁性核心

磁珠内部通常含有具有超顺磁性的Fe₃O₄或Fe₂O₃纳米粒子，在外加磁场作用下可迅速响应并聚集，而在撤除磁场后不保留宏观磁性（无明显磁滞），便于再次分散与重复使用。

（2）外层包覆与表面活性基团

磁性核心外层包覆琼脂糖、二氧化硅、聚合物或葡聚糖等基质，通过进一步衍生化引入特定化学或生物配体，与蛋白、核酸或其他分子发生物理、化学或生物学相互作用。

3.2按基质类型划分的磁珠

（1）琼脂糖磁珠

采用“Fe₃O₄为核、琼脂糖为壳”的核/壳结构，兼具天然多孔结构和良好亲水性，对蛋白具有较高生物相容性，可方便引入多种功能基团，是蛋白/抗体纯化中应用最广泛的磁珠类型之一。

（2）二氧化硅磁珠

以二氧化硅为外壳，表面易于进行硅醇基团衍生化，适合核酸结合、表面修饰及某些特殊蛋白纯化需求。

（3）聚合物磁珠

以交联有机聚合物为壳层，具有较好的机械与化学稳定性，可用于构建多种功能化磁珠，适配复杂或较严苛的缓冲体系。

（4）葡聚糖及其他磁珠

以葡聚糖等多糖为基质的磁珠具有良好亲水性和生物相容性，可用于特定亲和体系或细胞/病毒富集等专门应用。

3.3蛋白纯化常用功能化磁珠

（1）抗体纯化磁珠

以Protein A、Protein G、Protein L等Fc或轻链识别配体为功能基团的琼脂糖磁珠，是单克隆抗体、多克隆抗体和抗体片段纯化的主力介质，具备高特异性高载量的“捕获”能力。

（2）标签蛋白纯化磁珠

针对带有His、GST、Strep等标签的重组蛋白，可分别采用Ni-IDA/NTA、GSH、Strep-tactin/SA等配体磁珠，通过金属螯合或特异性配体结合实现高效捕获与洗脱，简化纯化流程。

四、按分离机理分类的纯化介质

4.1凝胶过滤（GF）

基于分子大小差异实现分离；大分子先洗脱，小分子后洗脱。适用于去除聚集体、小分子杂质或进行缓冲液置换，是精制阶段常用的“抛光”和终末手段。

4.2离子交换层析（IEX）

利用蛋白表面净电荷与带正（阳离子交换）或带负（阴离子交换）基团之间的静电相互作用进行结合与洗脱，具有高载量与高分辨率，适用于捕获、中度纯化与精制的多个阶段。

4.3亲和层析（AC）

依赖“配体—靶蛋白”的特异识别（如Protein A–IgG、His–Ni²⁺、生物素–亲和素等），具有极高选择性和较高载量，常用于捕获阶段快速富集目标蛋白并显著降低杂质负荷。

4.4疏水作用层析（HIC）

在较高盐浓度下利用疏水侧链与固定相疏水基团之间的相互作用实现分离，适用于按疏水性差异进行中度纯化或抛光，可有效分离构象略有差异或修饰状态不同的蛋白。

4.5反相层析（RPC）

在有机溶剂体系中利用较强疏水作用进行分离，分辨率高，但条件相对“苛刻”，对蛋白构象可能具有变性风险，多用于分析级别或对耐受性较高的目标分子进行精制。

五、基于蛋白性质的纯化方法选择

5.1电荷性质与离子交换层析

当目标蛋白与主要杂蛋白在等电点或pI上存在显著差异时，可优先考虑离子交换层析：

（1）针对带正电的蛋白，可采用阳离子交换介质；

（2）针对带负电的蛋白，可采用阴离子交换介质；

通过缓冲液pH与离子强度梯度洗脱，实现高分辨率分离。

5.2分子大小与凝胶过滤

当目标蛋白分子量与聚集体、降解片段或其他蛋白存在明确大小差异时，凝胶过滤层析是非常直接的选择；同时可兼作缓冲置换或“终抛光”步骤。

5.3疏水性与HIC/RPC

（1）中等疏水性的蛋白可通过HIC区分构象差异或去除疏水性杂质；

（2）对极端疏水或耐有机溶剂蛋白，或用于分析级别分离，可采用RPC，但需注意对蛋白活性的潜在影响。

5.4生物识别与亲和层析

若目标蛋白具备特异性配体（抗体、His/GST/Strep标签、糖链识别等），优先考虑亲和层析以实现高选择性捕获，大幅简化下游纯化流程。

5.5特殊场景中的膨胀床吸附（EBA）

针对发酵液或高颗粒含量粗样本，可考虑电荷或配体特异性驱动的膨胀床吸附，实现在未完全澄清前进行捕获，提高整体工艺效率。

六、阿拉丁相关产品

6.1磁珠分离介质一览

货号	名称	介质类型	配体或靶标	分离机理	级别和纯度
F1373479	Anti-Flag 纳米抗体磁珠	纳米抗体磁珠	Flag	亲和	BioReagent, Magnetic Bead Content: ≥10 mg/mL; Bead Diameter: 2 μm
G1373495	Anti-GFP 纳米抗体磁珠	纳米抗体磁珠	GFP	亲和	BioReagent, Magnetic Bead Content: ≥10% (V/V); Bead Diameter: 10-30 μm
H1373485	Anti-HA 纳米抗体磁珠	纳米抗体磁珠	HA	亲和	BioReagent, Magnetic Bead Content: ≥10 mg/mL; Bead Diameter: 2 μm
V1373489	Anti-V5 纳米抗体磁珠	纳米抗体磁珠	V5	亲和	BioReagent, Magnetic Bead Content: ≥10 mg/mL; Bead Diameter: 2 μm
M1373496	Anti-mCherry 纳米抗体磁珠	纳米抗体磁珠	mCherry	亲和	BioReagent, Magnetic Bead Content: ≥10% (V/V)
P8103	Protein A 磁珠	Protein磁珠	Protein A	亲和	i-Quip™, Shell: hydrophilic polymer; Concentration: 2 mg/mL
P8104	Protein G 磁珠	Protein磁珠	Protein G	亲和	i-Quip™, 外壳：亲水高分子浓度：2 mg/mL
P751576	Protein A/G磁珠	Protein磁珠	Protein A/G	亲和	BioReagent, for IP, for CoIP, 10 mg/mL, 200 nm
P751577	Protein A磁珠	Protein磁珠	Protein A	亲和	BioReagent, for IP, for CoIP, 10 mg/mL; 200 nm
P751579	Protein G磁珠	Protein磁珠	Protein G	亲和	BioReagent, for IP, for CoIP, 10 mg/mL; 200 nm
A751537	UltraBio™ Anti-Flag Magnetic Beads (Anti-Flag磁珠)	抗标签磁珠	Flag	亲和
A751538	UltraBio™ Anti-GFP Magnetic Beads (Anti-GFP磁珠)	抗标签磁珠	GFP	亲和
A751539	UltraBio™ Anti-GST Magnetic Beads (Anti-GST磁珠)	抗标签磁珠	GST	亲和
A751540	UltraBio™ Anti-HA Magnetic Beads (Anti-HA磁珠)	抗标签磁珠	HA	亲和
A751541	UltraBio™ Anti-His Magnetic Beads (Anti-His磁珠)	抗标签磁珠	His	亲和
A751542	UltraBio™ Anti-MBP Magnetic Beads (Anti-MBP磁珠)	抗标签磁珠	MBP	亲和
A751543	UltraBio™ Anti-Myc Magnetic Beads (Anti-Myc磁珠)	抗标签磁珠	Myc	亲和
A751545	UltraBio™ Anti-V5 Magnetic Beads (Anti-V5磁珠)	抗标签磁珠	V5	亲和
M751555	UltraBio™ GST标签蛋白纯化琼脂糖磁珠	琼脂糖磁珠	GST	亲和	BioReagent, 20% v/v; particle size: 30-100 μm
I751556	UltraBio™ His标签蛋白纯化琼脂糖磁珠 (IDA-Ni)	琼脂糖磁珠	His / IDA-Ni	IMAC	BioReagent, 20% v/v; particle size: 30-100 μm
N751557	UltraBio™ His标签蛋白纯化琼脂糖磁珠(NTA-Ni)	琼脂糖磁珠	His / NTA-Ni	IMAC	BioReagent, 10% v/v
T751558	UltraBio™ His标签蛋白纯化琼脂糖磁珠(TED-Ni)	琼脂糖磁珠	His / TED-Ni	IMAC	见COA
S1375268	UltraBio™ Strep Tactin琼脂糖磁珠	琼脂糖磁珠	Strep-tag	亲和	BioReagent, 20% v/v; particle size: 10-37 μm
S751585	UltraBio™ Streptavidin Magnetic Beads (链霉亲和素磁珠)	配体磁珠	Biotin	亲和
S1375699	UltraBio™ 链霉亲和素磁珠 (1μm)	配体磁珠	Biotin	亲和	BioReagent, 10 mg/mL; particle size: 1 μm
C751552	UltraBio™ 伴刀豆球蛋白A磁珠 (1μm)	配体磁珠	Con A	亲和	BioReagent, 10 mg/mL; particle size: 1 μm
S1375270	UltraBio™ Heparin琼脂糖磁珠	琼脂糖磁珠	Heparin	亲和	BioReagent, 20% v/v; particle size: 10-37 μm
P1373640	UltraBio™ Protein A/G 琼脂糖磁珠	琼脂糖磁珠	Protein A/G	亲和	BioReagent, 20% v/v
P1373637	UltraBio™ Protein G 琼脂糖磁珠	琼脂糖磁珠	Protein G	亲和	BioReagent, 10% v/v
P1374921	UltraBio™ Protein L琼脂糖磁珠	琼脂糖磁珠	Protein L	亲和	BioReagent, 20% v/v; particle size: 10-37 μm
A1374216	UltraBio™ 耐碱Protein A琼脂糖磁珠	琼脂糖磁珠	Protein A	亲和	BioReagent
P751578	UltraBio™ Protein G Plus磁珠	Protein磁珠	Protein G	亲和
M751561	UltraBio™ Mouse IgG Magnetic Beads (小鼠IgG磁珠)	IgG磁珠	Mouse IgG	亲和
R751580	UltraBio™ Rabbit IgG Magnetic Beads (兔IgG磁珠)	IgG磁珠	Rabbit IgG	亲和

6.2凝胶填料分离介质一览

货号	名称	介质类型	配体或靶标	分离机理	级别和纯度
A743822	Anti-Flag 亲和层析介质	亲和层析介质	Flag	亲和	BioReagent, 50% v/v
A1492561	Anti-GFP 亲和层析介质	亲和层析介质	GFP	亲和	BioReagent, 50% v/v
A743823	Anti-HA 亲和层析介质	亲和层析介质	HA	亲和	BioReagent, 50% v/v
A1492562	Anti-RFP 亲和层析介质	亲和层析介质	RFP	亲和	BioReagent, 50% v/v
A1492563	Anti-YFP 亲和层析介质	亲和层析介质	YFP	亲和	BioReagent, 50% v/v
A743824	Anti-c-Myc 亲和层析介质	亲和层析介质	c-Myc	亲和	BioReagent, 50% v/v
S1492532	Strep-tag II 标签亲和层析介质	亲和层析介质	Strep-tag II	亲和	BioReagent, 50% v/v
N928427	Ni-IDA 亲和层析介质 (His tag)	IMAC介质	His / Ni-IDA	IMAC	BioReagent, 用于蛋白分析, 25-35 mg His-Tagged protein/mL wet gel; 75 μm
N928428	Ni-NTA 亲和层析介质 (His tag)	IMAC介质	His / Ni-NTA	IMAC	BioReagent, 用于蛋白分析, 30-35 mg His-Tagged protein/mL wet gel; 75 μm
N901622	Ni-TED 亲和层析介质 (His tag)	IMAC介质	His / Ni-TED	IMAC	BioReagent, 用于蛋白分析, 10 mg His-Tagged protein/mL wet gel; 75 μm
N5275	Ni亲和层析介质	IMAC介质	IMAC / Ni	IMAC	i-Quip™, 粒径: 90 μm; 载量: ≥25 mg Myoglobin/mL
A5218	Protein A40亲和层析介质	亲和层析介质	Protein A	亲和	i-Quip™, 粒径: 40 μm; 载量: ≥30 mg hIgG/mL
P749482	rProtein A/G 亲和层析介质	亲和层析介质	Protein A/G	亲和	BioReagent, 通过内毒素测试, 50% v/v
P749485	rProtein G 亲和层析介质	亲和层析介质	Protein G	亲和	BioReagent, 50% v/v
P1492529	rProtein L 亲和层析介质	亲和层析介质	Protein L	亲和	BioReagent, 通过内毒素测试, 50% v/v
P405880	耐碱 rProtein A 亲和层析介质	亲和层析介质	Protein A	亲和	BioReagent, 50% v/v
N1492641	NHS 活化亲和层析介质	偶联活化介质	NHS活化	共价偶联	BioReagent, 50% v/v
N1492642	NHS 活化亲和层析介质（长臂）	偶联活化介质	NHS活化	共价偶联	BioReagent, 50% v/v
B1492533	Blue 亲和层析介质	亲和层析介质	Blue配体	亲和	BioReagent, 50% v/v
C1492535	Con A 亲和层析介质	亲和层析介质	Con A	亲和	BioReagent, 通过内毒素测试, 50% v/v

蛋白纯化过程中，凝胶填料与磁珠并非简单的“耗材”，而是决定分离效率、纯度与工艺可放大的关键工程要素。通过理解不同基质类型（琼脂糖、葡聚糖、聚合物等）的物理化学特性，掌握各类分离机理（IEX、AC、HIC、GF、RPC）的适用场景，并将其与目标蛋白的电荷、大小、疏水性与生物识别特征对接，可构建逻辑清晰、阶段划分合理的纯化流程。合理选择并组合不同类型的层析填料与磁珠，不仅有助于提升纯度与回收率，也为后续工艺放大和质量控制打下坚实基础。

阿拉丁：https://www.aladdin-e.com/

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Da — 若无特别说明，分子量单位默认为道尔顿。 Mw — 重均分子量。 Mn — 数均分子量。

产品仅供科研与开发使用，不用于人体、动物、诊断或治疗。

引用本文

阿拉丁科学.《蛋白纯化中的分离介质选择：凝胶填料与磁珠的原理与应用》. 阿拉丁知识库，更新于 2025年12月24日。
                            https://www.aladdin-e.com/zh_cn/faqs/selection-of-separation-media-in-protein-purification.html

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