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文献证明
在色谱分析、有机合成和交叉偶联反应领域已被 0 篇同行评审文献引用。
概述
产品介绍
阿拉丁的UltraBio™ His标签蛋白纯化琼脂糖磁珠（TED-Ni），英文名为UltraBio™ TED-Ni Magnetic Agarose Beads for His-Tag Protein Purification，即TED-Ni His标签蛋白纯化磁珠、TED-Ni琼脂糖磁珠（Magarose）、TED-Ni磁珠或TED镍磁珠，由三羧甲基乙二胺（Tris (carboxymethyl) ethylenediamine, TED）共价偶联至琼脂糖磁珠，再通过TED的5个结合位点螯合二价镍离子（Ni2+）制备而成，可特异性地与动植物或者微生物裂解液、血清、腹水等样品中含有His标签的蛋白结合，从而用于带有His标签蛋白或蛋白复合物的纯化、免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）或免疫共沉淀（Co-IP）。本产品可以耐受常规水相溶液，50mM EDTA，5mM DTT，10mM NaOH。His标签（His-tag）、Flag标签、Myc标签（Myc-tag）、HA标签（HA-tag）和GST标签等是最常见的一些标签，通过与这些标签的融合表达可以非常方便地检测目的蛋白及与目的蛋白相互结合的蛋白，也可以非常方便地用于目的蛋白的纯化。His-tag是6个连续的组氨酸残基（HHHHHH）组成的多肽，通过基因重组技术把His-tag的核酸序列与目的基因的5'端或3'端连接，表达形成融合His-tag的目的蛋白。His-tag具有以下优点：His-tag分子量非常小，只有0.84kDa，通常不会与目的蛋白相互作用，并且大多数情况下不会影响目的蛋白的功能，通常不会形成二聚体，并对蛋白的下游应用没有影响；His-tag作为标签蛋白，后续通过His标签抗体对目的基因的表达、定位及功能进行检测，也可以通过His标签蛋白纯化琼脂糖磁珠或常规的His标签蛋白纯化介质对目的蛋白进行纯化、免疫沉淀或免疫共沉淀等；蛋白纯化步骤简便，纯化条件温和，且蛋白纯化完之后可以不必切除His标签，很多情况下也不会对蛋白的功能产生影响；可应用于多种蛋白表达系统，也可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签表达；N-端的His-tag与细菌的转录翻译机制兼容，有利于蛋白表达。基于以上优点，His标签已被广泛应用于蛋白表达、纯化、鉴定、相互作用和功能等多方面的研究。一般使用His标签蛋白纯化介质（镍柱）对His标签蛋白进行纯化，但对于带有His标签蛋白或蛋白复合物的少量纯化或免疫沉淀等应用，His标签蛋白纯化琼脂糖磁珠更简单、便捷。本产品是基于固定化金属离子亲和层析（Immobilized metal affinity chromatography, IMAC）技术研发而成。一个镍离子有六个配位位点，其与琼脂糖或琼脂糖磁珠相连接的桥梁通常是IDA（Iminodiacetic acid, 亚氨基二乙酸）、NTA（Nitrilotriacetic acid，次氮基三乙酸）或TED（Tris (carboxymethyl) ethylenediamine, 三羧甲基乙二胺）等螯合剂。IDA、NTA和TED分别拥有3、4、5个配位位点与镍离子结合，这样镍离子空余的能与组氨酸标签结合的位点为3、2、1个，所以TED与His标签蛋白结合能力较弱，但其特异性强，在高浓度螯合剂、还原剂和碱性环境下具有良好的耐受性，而IDA则相反，可结合较多的His标签蛋白，但特异性较弱。NTA与His标签蛋白的作用介于两者之间。UltraBio™ His标签蛋白纯化琼脂糖磁珠(TED-Ni)可特异性地结合His标签融合蛋白，并可以借助磁力架等磁分离设备非常便捷地应用于带有His标签的融合蛋白或其蛋白复合物的纯化或免疫沉淀等实验。本产品稳定性高、特异性强、靶蛋白结合量高。与国内外大多数的同类产品相比，本产品镍离子配基密度高，镍离子几乎不会脱落，对带有His标签蛋白的结合具有很强的特异性。本产品每毫升悬浊液含约25%琼脂糖磁珠沉淀，含有≥30μmol/mL的TED-Ni2+，通常每毫升磁珠（100%磁珠）可结合＞10mg His标签融合蛋白，具体的最大结合量和标签蛋白的分子量大小等相关。本产品可结合多种形式的His标签蛋白。本产品可特异性地结合N端His融合蛋白(His-Protein)、C端His融合蛋白(Protein-His)。本产品结合目的蛋白速度快。本产品使用了TED螯合的镍离子，粒径在40-100μm。本产品可高效洗脱His标签蛋白。本产品根据目的蛋白的结构、生物学功能及后续应用的要求等，使用咪唑(Imidazole)进行多次洗脱。洗脱时间短，洗脱效率高。本产品使用便捷。本产品储存在特殊保护液中，不含甘油，可以通过磁性吸附实现快速高效的分离，无需离心操作。本产品的主要指标如下表：本产品每毫升悬浊液中共含约0.25mL琼脂糖磁珠沉淀。本产品标注的体积为悬浊液总体积。每毫升悬浊液可以用于纯化约2mg分子量约为60kD的His标签蛋白。His标签蛋白分子量的大小会影响本产品可以纯化的目的蛋白的毫克数。性能参数
| Bead concentration | 25% (v/v) |
| Beads size | 40-100 μm |
| Magnetization | Superparamagnetic |
| Coupled Ligand | Tris (carboxymethyl) ethylenediamine (TED) |
| Chelating metal ion | Ni2+ |
| Metal ion density | ≥30μmol/mL beads (100%) |
| Binding capacity | >10mg His-tagged fusion protein per mL beads (100%) |
| Chemical stability | 50mM EDTA, 5mM DTT, 10mM NaOH |
实验建议
1.常用缓冲液
| Binding buffer | 20mM PhosphateBuffer, 500mM NaCl, 0-20 mM Imidazole, pH7.4 |
| Washing buffer | 20mM PhosphateBuffer, 500mM NaCl, 0-50 mM Imidazole, pH7.4 |
| Elution buffer | 20mM PhosphateBuffer, 500mM NaCl, <400mM Imidazole, pH7.4 |
| Storage buffer | 20% (v/v) Ethanol |
缓冲液的配制影响着目标蛋白的回收率和纯度，在纯化较大规模蛋白之前，用户应自行设计相关实验，筛选出适用于当前蛋白的缓冲液体系。在结合缓冲液中添加少量咪唑可以减少杂蛋白的吸附；洗脱时，不确定最佳洗脱咪唑浓度的情况下，推荐使用不同梯度洗脱，并收集上清液做SDS-PAGE电泳验证，确定合适的洗脱浓度。
2.操作流程
2.1样品制备
取适量的表达细胞用Binding buffer稀释，加入蛋白酶抑制剂（例如：终浓度为1mM的PMSF），搅拌混合均匀，冰浴超声裂解细胞，即为粗蛋白样品。
2.2磁珠预处理
取一定量磁珠至10mL EP管中，置于磁力架上，使磁珠悬浮液沉降，移除上层的Storage buffer，用与磁珠10倍体积的Binding buffer洗涤2-3次，磁性分离后保留磁珠备用。
2.3目标蛋白吸附将磁珠加入步骤2.1的样品中，在室温下使用垂直混合仪或手动轻柔翻转EP管，使磁珠充分的分散在样品溶液中，约30min后进行磁性分离，移出上清液，留样检测或废弃（对于部分易降解的蛋白，建议在2~8°C下孵育1h以上）。
2.4游离蛋白去除
在上一步EP管中加入10倍磁珠体积的Washing buffer，翻转重悬磁珠后进行磁性分离，移出上清液，留样检测或废弃；重复2-3次即可。
2.5目标蛋白洗脱
将5倍磁珠体积的Elution Buffer加入上一步的EP管中，在室温下使用垂直混合仪或手动轻柔翻转EP管，使磁珠充分的分散，10min后进行磁性分离，移取上清液至新EP管；若要确保蛋白充分回收，可重复1-2次。
2.6磁珠后处理
使用后的磁珠用Elution Buffer洗涤2次，磁性分离后移除上清液；之后用去离子水洗涤3次，磁性分离后移除上清液；再用Storage Buffer洗涤3次，磁性分离后移除上清液；加入Storage Buffer使磁珠浓度为25%（v/v），置于2-8°C保存。
3．磁珠再生
UltraBio™ His标签蛋白纯化琼脂糖磁珠（TED-Ni）在连续使用一定次数后，若出现载量明显下降的现象时，建议进行再生处理，需准备以下缓冲液：
| Beads washing buffer | 0.5-1M NaOH, 2M NaCl |
| Washing buffer | 20 mM Phosphate buffer, pH7.4 |
| Storage buffer | 20% (v/v) Ethanol |
（1）取结合性能降低的磁珠至10mL EP管中，磁性分离移除上清液，加入10倍磁珠体积的Beads washing buffer，重悬磁珠，在37°C摇床内震荡混合30min，磁性分离，去除上清液，重复1次。
（2）加入10倍磁珠体积的Washing buffer，手动翻转EP管使磁珠重悬，磁性分离后移除上清液，重复3次。
（3）再加入10倍磁珠体积的去离子水，手动翻转EP管使磁珠重悬，磁性分离后移除上清液，重复3-5次，至洗涤液呈中性为止。
（4）加入10倍磁珠体积的Storage buffer，手动翻转EP管使磁珠重悬，磁性分离后移除上清液，重复2次，最后加入Storage buffer使磁珠浓度为25%（v/v），置于2-8°C保存。
注意事项
1.磁珠应保存在储存溶液中，请勿离心、干燥或冷冻磁珠，因此产生的磁珠聚集会严重影响产品的性能。
2.建议磁珠仅重复纯化同种蛋白，当纯化性能降低时，可进行再生处理。
3.磁珠应与磁力架配套使用，在使用过程中，应保持磁珠吸附一定时间之后，再通过移液器移取上清液，避免磁珠吸附不完全导致的磁珠损耗。
4.本产品仅供研究使用。
常见问题及解答
Q：如何提高蛋白回收率？
A：1.增加磁珠用量
2.延长孵育时间
3.增加目标蛋白洗脱时间及洗脱次数
4.添加合适的蛋白酶抑制剂
5.适当降低样品和Binding/WashingBuffer中的咪唑浓度
6.在样品和缓冲液中添加适量的表面活性剂等物质
Q：如何提高目标蛋白纯度？
A：1.改变咪唑浓度，梯度洗脱目标蛋白
2.添加合适的蛋白酶抑制剂
3.适当提高样品和Binding/Washing Buffer中的咪唑和NaCl浓度
4.在样品和缓冲液中添加适量的表面活性剂等物质。
规格
产品名称
UltraBio™ His标签蛋白纯化琼脂糖磁珠(TED-Ni)
规格或纯度
见COA
分子类型
生物试剂/缓冲液
储存与运输
浓度
见COA
储存条件
2-8°C储存
运输条件
低温运输
稳定性与储存
20%乙醇，2-8°C 下长期保存（12 个月）。
技术文档
高级数据
质检证书（CoA,COO,BSE/TSE 和分析图谱)
C of A & Other Certificates(BSE/TSE, COO):
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| 批号(Lot Number) | 证书类型 | 货号 |
|---|---|---|
 ZJ24F1113250 |
分析证书 | T751558 |
| ZJ24F1113251 |
分析证书 | T751558 |
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