亲和层析介质通过固定化配基与目标分子的特异性或高选择性相互作用实现分离。His标签蛋白可利用Ni²⁺或Co²⁺金属螯合介质捕获，GST、MBP和Strep标签分别对应谷胱甘肽、糊精和Strep类配基；硼酸介质可识别含顺式二醇结构的分子，硫酸化介质可用于部分蛋白和病毒颗粒的富集，CNBr活化介质则用于自定义配基偶联。

        关键词：亲和层析介质；金属螯合；His标签；硼酸亲和；硫酸葡聚糖；活化介质；蛋白纯化

1 亲和层析介质的技术基础

1.1 亲和识别机制

        亲和层析依赖目标分子与固定化配基之间可逆且具有选择性的相互作用。His标签通过组氨酸咪唑基与固定化Ni²⁺、Co²⁺配位；GST与谷胱甘肽结合；MBP与Dextrin或Amylose类多糖配基结合；Strep-tag II与Strep-Tactin等配基结合；FLAG、HA、c-Myc、V5及GFP可利用相应抗体或纳米抗体进行捕获。非标签型体系中，硼酸基团可与顺式二醇形成可逆硼酸酯，硫酸化配基则通过硫酸基团介导的仿肝素作用及静电相互作用结合特定生物大分子。

1.2 基质与配基结构

        亲和层析介质通常由多孔基质、连接臂和功能配基组成。琼脂糖基质亲水性较好，适合蛋白及其他生物大分子纯化；高交联Fast Flow基质机械强度更高，可在较高流速和柱压条件下运行。孔径影响大分子进入介质内部的扩散，配基密度决定潜在结合位点数量，而连接臂长度和配基空间暴露则直接影响目标分子的可及性。

1.3 结合容量与选择性

        结合容量反映单位体积介质能够捕获的目标物量，选择性则决定杂质与目标分子的分离程度。配基密度较高时可增加理论载量，但也可能扩大非特异吸附；更严格的分子识别通常能够降低背景，但弱结合目标更容易在上样或洗涤阶段流失。实际性能可通过Input、Flow-through、Wash和Elution中目标蛋白的分布判断。

2 His标签与金属螯合亲和介质

        固定化金属离子亲和层析（Immobilized Metal Affinity Chromatography，IMAC）通过IDA、NTA、羧甲基天冬氨酸等螯合配基固定Ni²⁺或Co²⁺，再由His标签中的咪唑基参与金属配位完成捕获。金属种类及螯合配基结构共同影响载量、选择性和金属稳定性。

2.1 Ni-IDA亲和介质

（1）结合特点

        IDA固定Ni²⁺后仍保留较多可供His标签参与配位的金属位点，因此通常具有较高结合容量。His标签蛋白可在中性至弱碱性条件下结合，随后利用咪唑竞争金属配位位点完成洗脱。

（2）主要优势

        Ni-IDA适合高表达His标签蛋白的捕获，尤其适用于需要较高介质载量的初步纯化。6FF等高交联基质还可提高流速和机械稳定性，用于较大体积样品处理。

（3）主要局限

        开放金属配位位点较多时，宿主细胞中天然富含His、Cys等残基的蛋白也可能发生吸附。提高洗涤液中的咪唑和盐浓度可减少部分背景，但过高咪唑会使结合较弱的目标蛋白提前流失。

2.2 Ni-NTA亲和介质

（1）结合特点

        NTA对Ni²⁺的螯合程度高于IDA，同时保留可供His标签结合的金属配位位点。其金属固定稳定性和目标蛋白载量之间较为均衡，是常见的His标签亲和介质。

（2）主要优势

        Ni-NTA可用于天然条件纯化，也可用于部分含尿素或盐酸胍的变性体系。常规His标签蛋白可通过提高咪唑浓度进行竞争洗脱，适用于从表达筛选到制备级纯化的多种规模。

（3）主要局限

        EDTA等螯合剂可竞争固定金属离子，部分还原剂在较高浓度下也可能影响介质稳定性。样品中天然金属结合蛋白仍可能产生共纯化现象。

2.3 Co-NTA亲和介质

（1）结合特点

        Co-NTA以Co²⁺作为His标签结合中心。Co²⁺对部分非标签宿主蛋白的结合较弱，因此常表现出较低的非特异背景。

（2）主要优势

        Co-NTA适合Ni²⁺介质洗脱物中仍存在较多背景蛋白的情况，尤其适用于低丰度His标签蛋白或对一次纯化纯度要求较高的样品。

（3）主要局限

        Co²⁺体系通常不以最高载量为主要特征。标签暴露不足或目标蛋白与金属位点结合较弱时，流穿损失可能增加。

2.4 Co羧甲基天冬氨酸亲和介质

（1）结合特点

        Co羧甲基天冬氨酸介质利用羧甲基天冬氨酸类螯合配基固定Co²⁺，形成另一类His标签金属亲和体系。配基结构与NTA不同，因此金属固定方式和目标蛋白结合特征也存在差异。

（2）主要优势

        该介质可用于His标签蛋白纯化，也可与Co-NTA、Ni-NTA和Ni-IDA进行平行比较，以观察不同金属和螯合结构对目标蛋白纯度及回收率的影响。

（3）主要局限

        不同蛋白的His标签位置、周围氨基酸组成和构象暴露程度会明显影响Co²⁺介质结合效率，实际载量不能仅由金属类型推断。

2.5 金属螯合-IDA与NTA介质

        金属螯合-IDA和金属螯合-NTA介质预先固定螯合基团，但可由实验者进一步装载所需金属离子。该类介质适合比较Ni²⁺、Co²⁺等不同金属条件或开发特定IMAC方法。与预装金属介质相比，其操作中增加了金属装载、清洗和再生步骤，金属负载一致性会直接影响批间重复性。

表1 金属螯合亲和介质的主要差异

3 GST、MBP与Strep标签亲和介质

3.1 GST与谷胱甘肽亲和介质

（1）结合特点

        GST融合标签通过谷胱甘肽S-转移酶与固定化还原型谷胱甘肽之间的亲和作用完成捕获，随后利用游离还原型谷胱甘肽竞争洗脱。

（2）主要优势

        GST体系结合和洗脱条件较温和，可用于保持目标蛋白天然构象和活性，也可直接用于GST Pull-down等蛋白相互作用实验。GST融合还可提高部分重组蛋白的可溶表达水平。

（3）主要局限

        GST属于较大的融合标签，并具有形成二聚体的倾向，可能改变目标蛋白的空间结构、寡聚状态或相互作用特征。结构研究和定量互作实验中常需在纯化后切除GST标签。

3.2 MBP与Dextrin亲和介质

（1）结合特点

        MBP可与Dextrin或Amylose类多糖配基结合，并通过Maltose等竞争配体洗脱。该体系主要用于MBP融合蛋白的天然条件纯化。

（2）主要优势

        MBP融合可改善部分难溶蛋白的可溶性和折叠状态，对容易形成包涵体的重组蛋白具有较高应用价值。结合与洗脱过程通常较温和。

（3）主要局限

        MBP属于大分子融合标签，可能改变目标蛋白构象、分子量和复合物形成。去除MBP后还需要进一步分离游离MBP、切割酶和未完全切割的融合蛋白。

3.3 Strep-tag II亲和介质

（1）结合特点

        Strep-tag II为短肽标签，可与Strep-Tactin等Streptavidin衍生配基特异结合。Twin Strep-tag通过串联两个标签提高结合强度。

（2）主要优势

        Strep体系可在接近生理条件下结合，并通过Desthiobiotin等竞争配体进行温和洗脱，适合酶、蛋白复合物及对高浓度咪唑或酸性条件敏感的目标蛋白。

（3）主要局限

        Biotin可占据Strep类配基结合位点，样品中存在较高游离Biotin时会降低标签蛋白捕获效率。含Biotin培养添加剂的样品尤其需要控制其残留量。

4 FLAG、HA、Myc、V5与GFP抗体亲和介质

4.1 FLAG/DYKDDDDK、HA、Myc与V5标签介质

（1）结合特点

        FLAG/DYKDDDDK、HA、c-Myc和V5均属于表位标签，可通过固定化特异抗体或纳米抗体进行捕获。琼脂糖介质适合柱纯化和批量孵育，磁珠则适合IP、Co-IP和微量样品处理。

（2）主要优势

        短肽标签对目标蛋白分子量和结构负担较小，抗体介质具有较高识别特异性。竞争性标签肽洗脱可在较温和条件下释放目标蛋白及其相互作用复合物。

（3）主要局限

        抗体介质单位体积载量通常低于高容量IMAC介质，且大规模使用成本更高。低pH或变性洗脱会破坏部分蛋白活性，并可能降低介质重复使用次数。

4.2 GFP抗体与Nanobody介质

（1）结合特点

        GFP融合蛋白可通过Anti-GFP抗体或GFP Nanobody进行捕获，实现荧光成像、表达检测与亲和富集之间的衔接。

（2）主要优势

        GFP融合构建可在纯化前直接观察表达和亚细胞定位，随后进行IP、Co-IP或亲和纯化。Nanobody分子尺寸较小，可减少部分传统抗体介质产生的空间位阻。

（3）主要局限

        GFP属于较大的融合标签，可能影响目标蛋白定位、构象或复合物形成。对标签敏感的研究需要通过去标签或其他短标签体系验证。

5 硼酸亲和层析介质

5.1 结合机制

        苯硼酸类配基可与1,2-顺式二醇或其他适宜构型的邻二醇结构形成可逆硼酸酯。糖蛋白、糖类、核苷及部分核苷酸均可利用这一结构特征实现富集，不需要预先引入人工蛋白标签。

5.2 主要应用

        硼酸亲和介质适合糖基化蛋白、含糖链生物大分子及其他具有顺式二醇结构的化合物分离。糖蛋白捕获依赖糖链结构而不是蛋白一级序列，因此可用于不同来源糖蛋白的富集及糖基化相关分析前处理。

5.3 影响因素

        硼酸基团的电离状态和硼酸酯形成效率受pH明显影响。含有邻二醇结构的小分子可竞争介质结合位点，而部分蛋白还可能产生疏水或静电背景。改变pH或加入适宜多羟基竞争分子可破坏硼酸酯，实现目标物洗脱。

6 硫酸化亲和介质与生物大分子纯化

6.1 硫酸葡聚糖低硫介质

（1）结合特点

        低硫型硫酸葡聚糖介质表面固定硫酸化多糖，具有仿肝素型分子识别和较强负电荷特征。目标分子的结合可同时包含硫酸化多糖亲和作用和离子交换作用。

（2）主要应用

        该介质主要用于与硫酸化多糖具有结合能力的蛋白及部分血浆蛋白分离。提高盐浓度可削弱静电相互作用，从而实现结合蛋白洗脱。

（3）主要局限

        蛋白吸附可能同时来自特异性亲和和非特异性电荷作用。复杂样本中需要通过盐梯度观察目标峰与杂质峰的分离情况，以判断实际分离是否由有效选择性产生。

6.2 硫酸葡聚糖高硫介质

（1）结合特点

        高硫型硫酸葡聚糖介质具有更高密度的硫酸基团，可增强与部分病毒、病毒样颗粒以及其他具有相应表面结合特征的大分子之间的作用。

（2）主要应用

        该类介质主要用于病毒和VLP的捕获与富集。部分病毒表面蛋白能够与硫酸化多糖发生较强相互作用，因此可利用高硫介质建立病毒纯化步骤。

（3）主要局限

        较高硫酸基密度也会增强与其他带正电生物大分子的静电吸附。不同病毒的包膜组成、衣壳结构及表面蛋白差异明显，同一介质对不同病毒的结合容量和选择性可能存在较大差异。

6.3 硫酸酯修饰纤维素亲和介质

（1）结合特点

        硫酸酯修饰纤维素介质利用纤维素基质上的硫酸酯基团形成高密度负电表面，通过硫酸化结构和静电作用捕获具有相应结合特征的生物大分子。

（2）主要应用

        该介质可用于部分病毒、生物颗粒和大分子蛋白的富集。与硫酸葡聚糖琼脂糖相比，纤维素基质具有不同的孔结构、表面性质和传质特征，可形成不同的目标物结合表现。

（3）主要局限

        高结合量可能同时包含目标亲和作用与一般静电吸附。盐浓度、pH及目标颗粒尺寸均会影响实际分离结果。

表2 硼酸与硫酸化亲和介质的主要差异

7 活化型亲和介质与自定义配基偶联

7.1 CNBr活化介质

        CNBr活化介质并不预先提供针对特定目标物的识别配基，而是利用活化基团与蛋白、抗体、肽等分子中的伯氨基发生偶联。完成配基固定后，介质的识别能力由所偶联配基本身决定，可用于构建抗原—抗体、受体—配体、蛋白—蛋白等自定义亲和体系。

7.2 配基偶联特点

        CNBr偶联主要通过配基中的伯氨基进行，因此配基在介质表面的固定取向通常具有随机性。若参与偶联的氨基靠近配基活性区域，可能造成结合位点遮蔽。提高偶联量也不一定持续增加有效结合容量，因为过高配基密度可形成空间拥挤并降低大分子可及性。

7.3 4FF与常规活化介质

        4FF型活化介质采用机械强度更高的Fast Flow基质，可在较高流速和较大柱床中使用，更适合进一步放大。常规CNBr活化介质则可用于实验室规模配基偶联、重力柱和批量亲和捕获。两类介质的目标识别性质最终均由偶联配基决定。

8 介质形式与纯化规模

8.1 散装层析介质

        散装琼脂糖或其他多孔介质可用于自装柱、重力柱和中低压层析。柱床体积可随目标蛋白量调整，适合方法建立、参数比较和制备级蛋白纯化。

8.2 Fast Flow介质

        Fast Flow介质通过提高基质交联度增强机械强度，可承受较高线性流速和柱压。流速过高会降低目标分子在孔道内的扩散和接触时间，因此动态结合容量可能随停留时间缩短而下降。

8.3 磁性亲和介质

        磁珠可通过磁力架快速完成捕获、洗涤和洗脱，不需要装柱，适合IP、Co-IP、微量蛋白富集和多样本并行操作。磁性体系的优势主要体现在操作效率和微量样本回收，而不是大体积制备能力。

8.4 预装柱

        预装柱具有固定床高和装填状态，可减少人工装柱引起的流速分布和柱效差异。其适用于固定流程、重复批次样品及FPLC或中低压层析系统。

9 结合、洗涤与洗脱条件

9.1 金属螯合体系

        His标签在中性至弱碱性条件下通常具有较好的金属配位能力。低浓度咪唑用于抑制弱结合宿主蛋白，高浓度咪唑可竞争His标签与Ni²⁺或Co²⁺结合。EDTA等螯合剂可能去除固定金属离子，较高浓度还原剂也可能影响部分IMAC介质稳定性。

9.2 GST、MBP与Strep体系

        GST通常使用还原型谷胱甘肽竞争洗脱，MBP可使用Maltose洗脱，Strep体系可使用Desthiobiotin等竞争配体洗脱。竞争洗脱避免了强酸或强变性条件，但残留洗脱配体可能影响后续酶学、结合或定量实验。

9.3 硼酸亲和体系

        硼酸亲和结合依赖硼酸基团与顺式二醇形成可逆硼酸酯。降低适宜条件下的结合稳定性或加入可竞争硼酸位点的多羟基化合物，可释放被捕获分子。

9.4 硫酸化介质

        硫酸化介质中的静电作用通常可通过增加盐浓度削弱。盐梯度可用于定位目标物洗脱区间，同时观察非特异结合组分与目标峰之间的分离程度。

9.5 CNBr偶联介质

        CNBr活化介质在使用前需要完成配基偶联、未反应活性基团封闭及充分洗涤。偶联后的结合、洗涤和洗脱体系由所固定配基与目标分子的相互作用决定。

10 纯化结果判读

10.1 流穿组分中目标蛋白较多

        目标蛋白大量进入Flow-through通常与介质过载、标签未充分暴露、目标结构不具备有效亲和位点或结合条件破坏相互作用有关。介质过载时增加柱床体积能够降低流穿损失；标签被蛋白构象遮蔽时，仅增加介质量不会恢复结合。

10.2 洗涤组分中目标蛋白流失

        Wash中出现大量目标蛋白通常说明洗涤强度超过目标分子的结合稳定性。His体系中常见于咪唑浓度过高，硫酸化介质中可能由盐浓度过高引起，抗体或其他特异性介质则可能与低亲和配基—目标组合有关。

10.3 洗脱组分杂质较多

        His体系中的背景蛋白可通过提高洗涤咪唑和离子强度降低；硫酸化介质中的共洗脱常与静电吸附范围过宽有关；硼酸介质中具有邻二醇结构的非目标分子可与目标物竞争或共同结合。杂质来源不同，对应的洗杂机制也不同。

10.4 纯度较高但回收率偏低

        高纯度伴随低回收率常见于上样阶段未充分结合、洗涤过强或洗脱不完全。比较Input、Flow-through、Wash和Elution中目标蛋白分布，可以区分目标物损失发生在哪一阶段。

10.5 洗脱后蛋白活性下降

        高浓度咪唑、酸性洗脱、高盐、竞争配体及长时间纯化均可能改变部分蛋白构象或复合物状态。酶活降低但SDS-PAGE纯度正常时，需要进一步检查洗脱条件和蛋白缓冲环境，而不是仅以纯度判断纯化效果。

11 亲和层析介质及配套产品

11.1 His标签与金属螯合介质

11.2 GST、MBP与Strep标签亲和产品

11.3 硼酸与硫酸化亲和介质

11.4 活化型亲和层析介质

11.5 FLAG、HA、Myc、V5与GFP标签产品

        亲和层析介质主要包括金属螯合、标签配基、抗体亲和、硼酸亲和、硫酸化亲和和活化偶联体系。Ni²⁺/Co²⁺介质主要用于His标签蛋白，谷胱甘肽、Dextrin和Strep类介质分别用于GST、MBP和Strep标签；硼酸介质利用顺式二醇结构实现富集，硫酸化介质用于部分蛋白和病毒颗粒捕获，CNBr活化介质则用于构建自定义亲和体系。

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