镍琼脂糖微球通常呈蓝色，源于Ni²⁺与固定相配体的配位络合。运行含还原剂的纯化体系时，若发生金属还原或配位环境剧变，微球的外观颜色可能由蓝色转为棕色或黑色。

一、现象与化学本质

1.颜色变化的本质：出现棕/黑色通常指示固定相上的Ni²⁺被部分还原为低价态（Ni¹⁺）或金属态（Ni⁰），其配位/电子结构与光谱特征不同于Ni²⁺，从而改变可见外观。

2.主要诱因：高浓度还原剂（如DTT、TCEP、β-巯基乙醇）在上样、洗涤或长时间平衡条件下与固定相接触，促进Ni²⁺还原；高温、长时间停留、低pH与高硫醇负荷等因素可进一步放大该效应。

3.与其他致色因素的区分：非还原性褪蓝（如蛋白大量结合致暂时变浅）通常可在洗脱后恢复；而还原致棕/黑色在洗脱后往往不恢复，且伴随结合容量下降。

二、常见变色机理

三、阿拉丁产品

用于各种表达来源（如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞）的组氨酸标签（6xHis-tagged）蛋白的纯化。它是以磁性琼脂糖凝胶微球为基础，通过化学方法偶联了三配位的亚氨基二乙酸（IDA），螯合镍离子（Ni²⁺）后，可以形成比较稳定的骨架结构，从而有更多的位点与组氨酸标签上的咪唑环继续配位，达到结合目的蛋白的效果。

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UltraBio™ His 标签蛋白纯化琼脂糖磁珠 (IDA-Ni)产品化学结构示意图

UltraBio™ His标签蛋白纯化琼脂糖磁珠(TED-Ni)（货号T751558）

由三羧甲基乙二胺（Tris (carboxymethyl) ethylenediamine, TED）共价偶联至琼脂糖磁珠，再通过TED的5个结合位点螯合二价镍离子（Ni2+）制备而成，可特异性地与动植物或者微生物裂解液、血清、腹水等样品中含有His标签的蛋白结合，从而用于带有His标签蛋白或蛋白复合物的纯化、免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）或免疫共沉淀（Co-IP）。

UltraBio™ His标签蛋白纯化琼脂糖磁珠(NTA-Ni)（货号N751557）

专为组氨酸标签（His-tag）蛋白纯化而设计的新型功能化材料，与传统的金属螯合琼脂糖或者葡聚糖预装柱相比，无需对样品进行多次长时间的高速离心和滤膜过滤、无需控制流速、更无需高昂的层析设备。Ni-NTA琼脂糖磁珠具有顺磁性，借助外加磁场易实现目标蛋白的分离与纯化；操作简单，一步纯化即可获得高纯度的组氨酸标签蛋白；可通过洗脱液体积控制目标蛋白浓度，方便后续的样品处理，Ni磁珠可简单再生、重复使用。Ni-NTA琼脂糖磁珠适合原核细胞（如大肠杆菌）表达的可溶性组氨酸标签蛋白的纯化。

四、常见问答

Q：非用不可的DTT怎么办？

A：尽量在上样前通过脱盐柱把DTT降到≤0.5 mM；结合/洗涤全程不用还原剂；洗脱后立刻在回收的蛋白溶液中补加DTT/TCEP。

Q：可以用磷酸盐缓冲做IMAC吗？

A：不推荐在结合/洗涤阶段使用；若必须，用≤10 mM、短时，并监控颜色与背压；更稳妥方案是Tris/HEPES系。

Q：能否用过氧化氢/强氧化剂清洗？

A：不建议，可能损伤配体与琼脂糖骨架，优先用NaOH、尿素/胍与EDTA的组合工艺。