棒状杆菌鉴别的核心，不是单纯判断细菌是否呈杆状，而是要同时理解菌体形态、排列方式、染色特征和异染颗粒之间的关系。革兰染色用于建立基础形态判断，Neisser染色和Albert染色则进一步显示异染颗粒，三者共同构成白喉样棒状杆菌初步鉴别中的形态学观察框架。

关键词：棒状杆菌；白喉棒状杆菌；类白喉杆菌；革兰染色；Neisser染色；Albert染色；异染颗粒；Babes-Ernst小体；细菌形态学鉴别

1 棒状杆菌的基本常识

1.1 棒状杆菌的形态特点

（1）菌体形态

        棒状杆菌是一类形态不规则的杆状细菌，菌体可表现为短杆状、棒状、楔形、锤状或略弯曲杆状。部分菌体一端或两端略膨大，因此在显微镜下不像典型肠杆菌那样呈均一杆状，而常具有明显多形性。

（2）排列方式

        棒状杆菌分裂后菌体常不完全分离，并以一定角度排列，因此可见V形、L形、栅栏状、放射状或类似“中文样”排列。这种排列方式是棒状杆菌形态学识别中的重要线索，但不是某一种棒状杆菌的专属特征。

（3）革兰属性

        多数棒状杆菌在新鲜培养物中呈革兰阳性，革兰染色下多为紫色或蓝紫色杆菌。培养时间过长、菌体老化、脱色过度或抗菌药物影响时，可出现染色不均、节段状染色或革兰可变。

1.2 白喉棒状杆菌与类白喉杆菌

（1）白喉棒状杆菌

        白喉棒状杆菌是棒状杆菌中最具临床意义的成员之一，可引起白喉相关感染。显微形态上，其常表现为革兰阳性棒状杆菌，并可出现明显异染颗粒。需要注意的是，形态学结果只能提示疑似，不能直接确认菌种或产毒性。

（2）类白喉杆菌

        临床样本和环境中还可见多种非白喉棒状杆菌，常被称为类白喉杆菌。它们也可能呈革兰阳性棒状、栅栏状排列或不规则排列，部分菌株可见颗粒样结构。因此，单凭显微形态难以可靠区分白喉棒状杆菌和其他棒状杆菌。

（3）鉴别关键

        棒状杆菌鉴别通常需要从三个层面推进：先看革兰属性和基本形态，再看是否具有异染颗粒，最后结合培养、生化鉴定、质谱鉴定、分子检测和毒力相关检测完成确认。

1.3 异染颗粒的意义

（1）结构定位

        异染颗粒又称极体或Babes-Ernst小体，常位于菌体一端或两端。其本质与菌体内聚磷酸颗粒有关，在特定染色条件下可与菌体本身呈现不同颜色。对白喉棒状杆菌而言，异染颗粒常具有较强的形态学提示意义。

（2）显微特征

        在特殊染色下，异染颗粒通常表现为位于菌体极端区域的深染颗粒，常呈点状、短棒状或小团块状。判读时不能只看是否存在深色点状结构，还应同时观察颗粒是否位于棒状菌体内部或两端、是否与菌体轮廓对应，以及菌体是否具有棒状杆菌典型排列方式。

（3）鉴别边界

        异染颗粒并不是白喉棒状杆菌的绝对专属结构。部分非白喉棒状杆菌或其他细菌在特定条件下也可能出现颗粒样染色表现。因此，异染颗粒阳性只能作为“白喉样棒状杆菌”的形态学提示，不能直接等同于白喉棒状杆菌确诊，更不能直接判断菌株是否产毒。

表1 棒状杆菌显微鉴别的观察层级

2 革兰染色在棒状杆菌鉴别中的应用

2.1 方法定位

（1）基础筛查作用

        革兰染色是棒状杆菌显微鉴别的基础方法，主要用于判断标本或培养物中是否存在革兰阳性棒状杆菌样细菌。该方法能够同时观察菌体颜色、形态、排列方式和样本背景，是是否进一步进行Neisser染色或Albert染色的重要前置依据。

（2）形态学入口作用

        对棒状杆菌而言，革兰染色的价值不只在于显示紫色或蓝紫色菌体，更在于观察菌体是否具有多形性、是否呈棒状或楔形、是否出现成角排列、栅栏状排列或“中文样”排列。若报告中只描述“革兰阳性杆菌”，而不补充形态和排列信息，对后续鉴别的指导价值会明显降低。

（3）样本背景评价

        在咽拭子、鼻咽分泌物、创面分泌物等直接标本中，革兰染色还可显示混合菌群、上皮细胞、白细胞和黏液背景。直接标本背景越复杂，单纯依靠显微形态判断棒状杆菌类别的可靠性越低，越需要结合分离培养物复核。

2.2 染色原理与典型结果

（1）染色机制

        革兰染色利用细菌细胞壁结构差异进行分类。革兰阳性菌细胞壁肽聚糖层较厚，初染后可较好保留结晶紫—碘复合物，脱色后仍呈紫色或蓝紫色。多数棒状杆菌在新鲜培养物中符合革兰阳性染色特征。

（2）典型形态

        棒状杆菌在革兰染色下通常表现为紫色或蓝紫色杆菌，菌体长短不一，可呈短杆状、棒状、楔形或轻度弯曲形态。典型排列包括单个散在、V形、L形、栅栏状或不规则成角排列。若革兰阳性、多形性杆状菌体和典型排列方式同时出现，可提示棒状杆菌样细菌。

（3）不典型表现

        培养物过老、脱色过度、涂片过厚或菌体受损时，棒状杆菌可出现染色变浅、染色不均、节段状染色或革兰可变。此时不能单纯依据颜色减弱排除棒状杆菌，应结合菌体形态、培养条件和重复染色结果综合判断。

2.3 适用场景

（1）直接标本初筛

        革兰染色适用于细菌感染标本的初步观察，可快速判断样本中是否存在革兰阳性棒状杆菌样细菌，并初步评估是否存在混合感染或背景污染。

（2）分离菌落复核

        对培养基上可疑菌落进行革兰染色，可判断菌落对应菌体是否符合棒状杆菌形态特征。与直接标本相比，分离菌落涂片背景更清晰，菌体来源更明确，更适合进行形态学判断。

（3）特殊染色前置判断

        当革兰染色提示可疑棒状杆菌样形态时，Neisser染色或Albert染色的结果才更具有解释价值。若革兰染色未见明确棒状杆菌样结构，单独进行异染颗粒染色容易产生误读。

2.4 判读限制

        革兰染色不能稳定显示异染颗粒，也不能判断棒状杆菌是否为白喉棒状杆菌，更不能判断菌株是否产毒。革兰染色结果宜表述为“可见革兰阳性棒状杆菌样细菌”或“可见革兰阳性杆菌，呈成角或栅栏状排列”，不宜直接报告为“白喉棒状杆菌阳性”。

3 Neisser染色在棒状杆菌鉴别中的应用

3.1 方法定位

（1）异染颗粒显示方法

        Neisser染色是显示棒状杆菌异染颗粒的经典特殊染色方法。其核心目的不是区分革兰阳性与革兰阴性，而是观察菌体内是否存在位于极端区域的深染颗粒。

（2）白喉样形态补充依据

        在疑似白喉棒状杆菌鉴别中，Neisser染色主要用于观察Babes-Ernst小体。若在棒状菌体一端或两端可见深染颗粒，并伴有成角排列或栅栏状排列，可增强白喉样棒状杆菌的形态学提示意义。

（3）与革兰染色的关系

        Neisser染色不是革兰染色的替代方法，而是革兰染色后的补充方法。只有在已经确认菌体具有棒状杆菌样形态时，Neisser染色显示的异染颗粒才具有明确解释价值。

3.2 染色原理与典型结果

（1）异染反应基础

        Neisser染色利用异染颗粒对特定染料的亲和性差异，使颗粒与菌体背景呈现不同颜色。异染颗粒富含聚磷酸成分，染色后通常呈深蓝色、蓝黑色或紫黑色。

（2）典型显微表现

        典型结果中，菌体一端或两端可见深染颗粒，菌体背景则相对较浅，可呈浅黄色、棕黄色或浅色调。实际颜色会随染液配方和实验条件变化，但核心判读点是颗粒深染、菌体相对浅染，并且颗粒与棒状菌体极端区域相对应。

（3）形态联合判读

        Neisser染色不能孤立观察深色颗粒。有效判读应同时满足三个条件：可见明确棒状菌体轮廓，颗粒位于菌体内部或两端，菌体排列符合棒状杆菌样特征。若仅见散在深染点，而无明确菌体轮廓，不应直接判定为异染颗粒阳性。

3.3 适用场景

（1）可疑分离培养物观察

        Neisser染色更适用于从培养基上挑取可疑菌落后制备涂片。分离培养物背景较少，菌体来源明确，能提高异染颗粒判读的可靠性。

（2）疑似白喉样棒状杆菌筛查

        当革兰染色提示革兰阳性棒状杆菌样细菌时，Neisser染色可进一步判断是否具有典型异染颗粒。该结果可作为白喉样棒状杆菌形态学筛查依据之一。

（3）实验教学与判读训练

        Neisser染色适合展示异染颗粒与菌体背景之间的颜色差异，有助于实验人员理解棒状杆菌“菌体形态”和“极体结构”的区别。

3.4 影响因素

（1）培养时间

        异染颗粒的显示与菌体生长状态有关。过老培养物可出现颗粒减少、菌体变形、背景染色增强或革兰可变；生长不足的菌体也可能颗粒不明显。进行形态观察时宜选择状态良好的新鲜培养物。

（2）涂片厚度

        涂片过厚会造成菌体重叠、背景偏深和颗粒边界不清；涂片过薄则菌量不足，影响观察。Neisser染色宜使用薄而均匀的涂片。

（3）染液状态

        染液沉淀、污染、放置时间过长或保存条件不当，均可能造成颗粒显示不清、菌体背景异常或颜色对比不足。特殊染色应配合质控菌株或已知对照进行验证。

3.5 判读限制

        Neisser染色阳性不能直接确认为白喉棒状杆菌，也不能证明菌株产毒。Neisser染色阴性也不能在所有情况下排除白喉样棒状杆菌，因为异染颗粒显示受培养条件、菌龄、染液质量和操作细节影响。报告表述应限定为“可见异染颗粒的棒状杆菌样细菌”或“形态学提示白喉样棒状杆菌”。

4 Albert染色在棒状杆菌鉴别中的应用

4.1 方法定位

（1）异染颗粒对比显示方法

        Albert染色同样用于显示棒状杆菌的异染颗粒。其特点是菌体背景与颗粒之间的颜色对比较为直观，有助于同时观察菌体轮廓和极端颗粒。

（2）疑似白喉棒状杆菌形态筛查

        Albert染色常用于疑似白喉棒状杆菌的形态学观察。若菌体呈绿色或蓝绿色，并在一端或两端出现深色颗粒，可提示白喉样棒状杆菌形态特征。

（3）形态教学价值

        Albert染色能够较直观地显示菌体与异染颗粒之间的差异，适合用于微生物形态学教学、特殊染色培训和疑似棒状杆菌的形态示范。

4.2 染色原理与典型结果

（1）菌体背景显示

        Albert染色下，棒状杆菌菌体常呈绿色或蓝绿色，菌体轮廓相对清楚，便于观察短杆状、棒状、楔形或不规则杆状形态。菌体轮廓是否完整，是判断颗粒是否真正位于菌体内的重要前提。

（2）异染颗粒显示

        异染颗粒通常呈蓝黑色、黑色或深色点状结构，多位于菌体一端或两端。若深染颗粒与菌体极端区域对应，并伴有V形、L形、栅栏状或成角排列，提示价值较高。

（3）颜色对比特点

        Albert染色的优势在于颗粒与菌体之间的反差相对明显。实际判读时不应只看颗粒颜色，而应综合菌体轮廓、颗粒位置、菌体排列和背景清洁程度。

4.3 适用场景

（1）可疑菌落快速观察

        对培养基上疑似棒状杆菌的菌落进行Albert染色，可较快观察菌体形态和异染颗粒。该方法适合作为疑似白喉样棒状杆菌的形态学复核手段。

（2）革兰染色后的补充观察

        当革兰染色已经显示革兰阳性棒状杆菌样形态时，Albert染色可进一步显示是否存在极端异染颗粒，从而增强对白喉样棒状杆菌的提示。

（3）教学与质量控制

        Albert染色因菌体与颗粒对比清楚，适用于教学示范和判读训练。实验室可通过标准菌株或典型图像建立内部判读参照，减少不同人员之间的主观差异。

4.4 影响因素

（1）染液新鲜度

        Albert染色对染液状态较敏感。染液放置过久、沉淀或污染可能导致背景深染、菌体颜色异常或颗粒对比不足。

（2）固定条件

        固定不足可导致菌体脱落，固定过度可能影响菌体结构和颗粒显示。固定应以保持菌体附着和结构完整为原则，避免过强处理。

（3）样本背景

        直接临床样本中的黏液、上皮细胞、炎性细胞和杂菌可干扰Albert染色判读。因此，Albert染色更适合分离培养物涂片，而不宜作为复杂直接样本中的孤立判断依据。

4.5 判读限制

        Albert染色不能替代培养鉴定、质谱鉴定、分子检测或毒力检测。其阳性结果只说明可疑棒状杆菌样细菌中存在异染颗粒样结构，不能直接确认白喉棒状杆菌，也不能判断产毒性。

5 三种染色方法的应用区别

5.1 观察目标不同

（1）革兰染色

        革兰染色主要观察细菌革兰属性、菌体形态、排列方式和样本背景。它回答的是“是否存在革兰阳性棒状杆菌样细菌”的问题，是棒状杆菌形态学鉴别的基础步骤。

（2）Neisser染色

        Neisser染色主要观察异染颗粒，尤其是位于菌体极端区域的深染颗粒。它回答的是“可疑棒状杆菌样细菌是否具有异染颗粒”的问题。

（3）Albert染色

        Albert染色同样观察异染颗粒，但更强调菌体背景与颗粒之间的颜色对比。它适合用于快速显示菌体轮廓和极体结构，尤其适合疑似白喉样棒状杆菌的形态观察。

5.2 结果意义不同

（1）革兰染色阳性

        革兰染色见革兰阳性棒状杆菌样细菌，提示可能存在棒状杆菌或类棒状杆菌，但不能确认具体菌种。

（2）Neisser或Albert染色颗粒阳性

        Neisser染色或Albert染色见异染颗粒，可增强对白喉样棒状杆菌的形态学怀疑，但仍不能确认白喉棒状杆菌，更不能判断是否产毒。

（3）三者联合提示

        若革兰染色显示革兰阳性棒状杆菌样细菌，菌体呈典型成角排列或栅栏状排列，同时Neisser染色或Albert染色显示明确异染颗粒，可报告为“形态学提示白喉样棒状杆菌”，并建议进一步鉴定和毒力检测。

表2 Neisser染色、Albert染色与革兰染色的核心区别

6 棒状杆菌鉴别中的推荐使用顺序

6.1 常规形态学筛查流程

（1）第一步：革兰染色

        首先进行革兰染色，观察是否存在革兰阳性棒状杆菌样细菌，并记录菌体形态、排列方式和样本背景。该步骤决定是否需要进一步进行特殊染色。

（2）第二步：Neisser染色或Albert染色

        当革兰染色提示可疑棒状杆菌样形态时，可选择Neisser染色或Albert染色观察异染颗粒。两种方法不必机械同时进行，可根据实验室染液体系、质控条件和判读经验选择。

（3）第三步：培养鉴定与毒力确认

        若形态学结果提示白喉样棒状杆菌，应进一步进行分离培养、菌种鉴定和毒力相关检测。显微染色只承担形态学筛查和方向提示作用，不能替代病原学确认。

6.2 不同应用场景下的方法选择

表3 不同场景下的染色方法选择策略

7 常见问题与注意事项

7.1 样本选择

（1）直接标本判读需谨慎

        咽拭子、鼻咽分泌物、创面分泌物等直接标本中常含有多种定植菌、上皮细胞、炎性细胞和黏液成分。直接涂片中即使出现棒状杆菌样结构，也只能作为初步线索。

（2）分离培养物更适合特殊染色

        Neisser染色和Albert染色更适合用于分离培养后的可疑菌落。培养物涂片可减少背景干扰，使菌体轮廓、排列方式和异染颗粒更容易判断。

（3）标本来源影响结果意义

        同样是棒状杆菌样细菌，来自血培养、深部组织、无菌体液或植入物相关标本时，临床意义通常高于口咽部或皮肤表面标本。显微结果应结合标本类型、临床表现和培养结果解释。

7.2 培养时间与菌体状态

（1）新鲜培养物更适合形态观察

        棒状杆菌的革兰染色和异染颗粒显示均与菌体生长状态有关。新鲜培养物通常形态较完整，革兰阳性较稳定，颗粒结构也更易观察。

（2）老龄培养物容易造成误判

        培养时间过长可导致菌体形态变形、染色不均、革兰阳性减弱或异染颗粒不典型。若观察结果与预期不符，应结合培养时间和重复涂片判断。

（3）培养基条件可能影响颗粒形成

        异染颗粒的形成与营养条件、菌体代谢状态和培养环境相关。特殊染色阴性不能在缺乏其他证据时直接排除白喉样棒状杆菌。

7.3 涂片与染色操作

（1）涂片厚度应适中

        涂片过厚会造成菌体重叠、背景深染和脱色不均；涂片过薄则可能菌量不足，影响颗粒观察。棒状杆菌的排列方式和异染颗粒均需要在薄而均匀的涂片中判读。

（2）固定过程不宜过度

        固定不足会造成菌体脱落，固定过度可能影响菌体结构和颗粒显示。固定应以保持菌体附着、减少形态破坏为原则。

（3）染液质量需要控制

        Neisser染色和Albert染色对染液状态较敏感。染液沉淀、污染、放置时间过长或配制条件变化，均可能导致颗粒显示不清或背景异常。实验室应结合质控菌株和标准操作体系进行结果确认。

7.4 结果报告注意事项

（1）避免形态学过度诊断

        显微染色报告不宜将“革兰阳性棒状杆菌样细菌”直接写成“白喉棒状杆菌”。形态学描述应保持层级清楚，避免超出染色方法本身的判断能力。

（2）避免将颗粒阳性等同于产毒性

        Neisser染色或Albert染色显示异染颗粒，只说明存在颗粒样结构。产毒性判断必须依赖毒素基因或毒素表达相关检测。

（3）建议使用限定性表述

        较合理的报告方式包括：“可见革兰阳性棒状杆菌样细菌”“菌体呈成角或栅栏状排列”“可见异染颗粒的棒状杆菌样细菌”“形态学提示白喉样棒状杆菌，建议进一步鉴定”。这类表述能够体现结果意义，同时避免确诊性误导。

8 棒状杆菌染色鉴别相关产品选型

表4 常用染色基础试剂

表5 棒状杆菌染色鉴别相关成套染液与即用型产品

        棒状杆菌鉴别中的三种染色方法应按观察层级理解。革兰染色用于建立革兰属性、菌体形态和排列方式的基础判断；Neisser染色和Albert染色用于进一步显示异染颗粒，强化对白喉样棒状杆菌的形态学提示。只有将染色结果与培养鉴定、分子检测和毒力确认结合，才能避免将显微形态误读为菌种确证或产毒性判断。

更多相关文章，详见下方：

[1] 白喉棒状杆菌毒力实验

[2] 白喉棒状杆菌形态观察实验

[3] 异染颗粒染色配制及染色方法实验