本方案叙述了从培养细胞和组织制备 DNA 样品的方法。病人或动物来源的白细胞也能用作 PFGE 的高分子质量 DNA 样品。如果确有必要，DNA 也可以从哺乳动物细胞分离出的胞核制备。经验表明：从胞核制备 DNA 没有优点，因为从完整细胞制备的 DNA 同样易于酶切。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。

操作方法

脉冲场凝胶电泳制备DNA（哺乳动物细胞和组织DNA的分离）

原理

本方案叙述了从培养细胞和组织制备 DNA 样品的方法。病人或动物来源的白细胞也能用作 PFGE 的高分子质量 DNA 样品。如果确有必要，DNA 也可以从哺乳动物细胞分离出的胞核制备。经验表明：从胞核制备 DNA 没有优点，因为从完整细胞制备的 DNA 同样易于酶切。

材料与仪器

细胞或组织样品
EDTA L 缓冲液 磷酸缓冲盐液 红细胞裂解缓冲液 TE
低熔点琼脂糖 Sorvall SS-34 或相当的转头 纱布 玻璃匀浆器 细胞计数板 LeucoPrep 细胞分离管 研钵和研杵 水浴

步骤

一、材料

1. 缓冲液和溶液

EDTA ( 0.5 mol/L, pH 8.0)

L 缓冲液（0.1 mol/L EDTA (pH 8.0)，0.01 mol/L Tris-Cl（pH 7.6)，0.02 mol/L NaCl，4℃ 贮存）

含蛋白酶 K 和十二烷基肌氨酸钠（Sarkosyl) 的 L缓冲液

磷酸缓冲盐液（PBS)

红细胞裂解缓冲液（155 mmol/L NH₄CI，0.1 mmol/L EDTA，12 mmol/L NaHCO₃，用此缓冲液分离白细胞）

TE ( pH 7.6)

含 40 μg/ml PMSF 的 TE pH 7.6

2. 凝胶

低熔点琼脂糖（1%)

3. 离心机和转头

Sorvall SS-34 或相当的转头

4. 专用设备

纱布

带有紧配合杵头的玻璃匀浆器，冰中预冷。

细胞计数板

LeucoPrep 细胞分离管（Becton Dickinson)

研钵和研杵，预冷到 -70℃

42℃ 和 50℃ 水浴

5. 细胞和组织

细胞或组织样品

二、方法

1. 制备细胞或组织样品。

(1) 培养细胞

① 用冰冷的 PBS 洗生长中的培养细胞 3 次。

② 用无菌的橡胶制刮细胞器收集至一个小体积冰冷的 PBS 内。

③ 以约 2X10⁷ 个细胞/ml 的浓度在冰冷的 L 缓冲液中混悬细胞。

(2) 新鲜组织样品

① 在培养皿内，用清洁的手术刀将新鲜组织切割成小块（1~2 mm³)。用预冷的玻璃匀浆器在冰冷的 PBS 内匀浆。

② 经两层纱布过滤除去结缔组织碎片。

③ 用冰冷的 PBS 洗混悬的细胞 3 次，再以约 2X10⁷ 个细胞/ml 的浓度在冰冷的 L 缓冲液中混悬细胞。

用血球计数器计算细胞数。

(3) 冰冻组织样品

① 用 -70℃ 预冷的研钵将冰冻组织研成粉末，然后混悬在冰冷的 PBS 中。

② 经两层纱布过滤除去结缔组织碎片。

③ 用冰冷的 PBS 洗混悬的细胞三次，再以约 2X10⁷ 个细胞/ml 的浓度在冰冷的 L 缓冲液中混悬细胞。

(4) 血液白细胞样品

① 用 LeucoPrep 细胞分离管经离心将 5~10 ml 血液粗分出白细胞和红细胞。

② 加 4 倍体积的红细胞裂解液到淡黄色的白细胞层，顛倒 2~3 次轻轻混合。

③ 在缓冲液中室温下温育 5 min，然后 3000 g ( 相当 Sorvall SS-34 转头 5000 r/min）室温下离心 5 min。

④ 在室温将沉淀用 1 ml PBS 混悬。

2. 用 L 缓冲液配制一体积 1% 低熔点琼脂糖，它相当于步骤 1 中细胞制备的体积。冷却熔化的琼脂糖到 42℃。

3. 琼脂糖降温至 42℃ 时，温热细胞悬液（步骤 1 ) 到相同温度。混合熔化的琼脂糖和混悬的细胞。用封口的巴斯德吸管搅动混合物以保证细胞完全均匀分散到琼脂糖中。

4. 吸出熔化的混合物移入预制的 Plexiglas 模具（50~100 μl，PHarmacia 或 BioRad )，或将混合物吸至适当长度的 Tygon 管（内径 1/8 英寸或 3.2 mm ) 或 1 ml 塑料注射器内。室温放置模具 15 min, 然后移至 4℃ 放置 15~30 min。

5. 琼脂糖凝结后，从 Plexiglas 模具轻轻收集凝胶栓，或者从 Tygon 管或注射器管轻轻吹出凝胶栓，放在培养皿内。将圆柱状的凝胶栓切成长 1 cm 的段。

6. 将凝胶栓移入 3 倍体积的含 0.1 mg/ml 蛋白酶 K 和 1% (m/V) Sarkosyl 的 L 缓冲液内。50℃ 温育 3 h。再用两倍体积新鲜的上述缓冲液替代用过的，继续 50℃ 温育 12~16 h。

7. 50 倍体积 TE ( pH 7.6) 3 h 内安排 3~5 次换液，室温温育凝胶栓。

8. 除去 TE，用两倍体积含 40 μg/ml PMSF 的 TE ( pH 7.6）50℃ 温育 30 min。

9. 用 50 倍体积 TE (pH 7.6) 3 h 内安排 3~5 次换液，室温温育凝胶栓。

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