介绍

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          1,2 Cu(I) 的来源包括碘化铜(I)、溴化铜(I)、匝铜或硫酸铜 (II) (CuSO4) 和还原剂。然而，Cu(I) 的热力学性质不稳定，很容易氧化成无活性的 Cu (II)，因此通常需要用适当的螯合配体来制备铜催化剂。

          点击化学的一项改进是利用抗坏血酸钠和稳定 Cu(I) 的配体--三(苄基三唑甲基)胺 (TBTA) 还原 CuSO4 来原位制备 Cu(I)。这避免了催化 Cu(I) 被溶解氧氧化，从而使点击反应更加可靠。在典型的反应中，硫酸铜会与 TBTA 预络合。将这种络合催化剂与炔烃和叠氮化物混合，然后加入抗坏血酸钠，启动点击反应。

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          除了水性共轭反应之外，TBTA 涵盖了点击化学的一些实际应用。水溶性三（3-羟基丙基三唑甲基）胺（THPTA）单击配体进一步简化了单击化学，允许整个反应在水中进行，为单击反应提供了生物兼容性。THPTA 配体被有效地用于高效标记活细胞，同时保持细胞活力。

          在我们的实验中，我们发现 THPTA 是一种用于点击化学反应的高效配体，部分用于完全水性反应。在室温下，只需 15-30 分钟即可完成标记。配体 CuSO4 复合物在冷冻至少一个月后也不会失去活性。

实验方案

标记寡核苷酸和 DNA

1. 配制以下储备溶液
- 200 mM THPTA 配体水溶液
- 100 mM CuSO4 水溶液
- 水中的炔烃标记寡聚物
- 100 mM 抗坏血酸钠（水溶液
- 10 mM 叠氮化物，溶于 DMSO/t-BuOH 或水

2. 在反应前几分钟，将 CuSO4 与 THPTA 配体按 1:2 的比例混合。该溶液冷冻后可稳定数周。
3. 在寡核苷酸/DNA 溶液中加入过量叠氮化物（4-50 eq）。
4. 加入 25 当量的 THPTA/CuSO4。
5. 加入 40 当量的抗坏血酸钠。
6. 让反应在室温下静置 30-60 分钟。
7. 乙醇沉淀寡聚物或纯化。

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细胞裂解物的标记
1. 配制以下点击溶液：
- 100 mM THPTA 配体水溶液或水
- 20 mM CuSO4 水溶液
- 300 mM 抗坏血酸钠水
- 2.5 mM 水或二甲基亚砜中的炔烃或叠氮标记试剂

2. 对于每个叠氮化或炔烃修饰的蛋白质裂解物样品，将以下物质加入 1.5 mL 的微量离心管中，然后短暂涡旋混合。
- 50 µL 蛋白提取缓冲液中的蛋白质裂解液（1-5 mg/mL）。
- 90 µL PBS 缓冲液
- 20 µL 2.5 mM 对应叠氮化物（或炔烃）检测试剂（DMSO 或水）； 3.
3. 加入 10 µL 100 mM THPTA 溶液，短暂涡旋混合。
4. 加入 10 µL 20 mM CuSO4 溶液，短暂涡旋混匀。
5. 加入 10 µL 300 mM 抗坏血酸钠溶液以启动点击反应，短暂涡旋混匀。
6. 防止光照，室温下孵育 30 分钟。
7. 现在裂解物中的蛋白质已被点击标记，可进行下游处理和/或分析。

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利用铜催化的炔吖啶点击化学标记活细胞

对 HeLa 和 CHO 细胞上的叠氮聚糖进行细胞表面标记并用共聚焦显微镜成像

          将 1 × 105 个细胞/毫升的细胞播种到玻璃底培养皿（35 毫米）中，在 37 °C、5% CO2 的条件下，在含有或不含有 50 μM Ac4ManNAz 的生长培养基（含 10%胎牛血清、1%谷氨酰胺和 1%五氯硝基苯的 MEM 培养基）中过夜生长 2 天。轻轻吸出培养基，用 1 mL DPBS 冲洗细胞两次。在一个 eppendorf 管中，以 1:5 的摩尔比将 CuSO4 和 THPTA 加入到 4 °C 的 DPBS 中，其中含有染料炔 1 或 2（最终浓度 25 μM）和氨基胍（最终浓度 1 mM）。加入新鲜制备的抗坏血酸钠储备液（100 mM），以确定抗坏血酸钠的最终浓度为 2.5 mM。将反应混合物加入细胞前在 4 ℃ 冰上孵育 10 分钟。在 4 ℃ 温育 1 或 5 分钟后，洗涤细胞并用 3% 多聚甲醛、0.3% 戊二醛和 1 mM MgCl2 在 DBPS 中的混合物在室温下固定 10 分钟。加入 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核进行染色。在每个步骤之间，用 DPBS 冲洗载玻片三次。使用 Vecta Shield 装片介质（Vector Laboratories, Burlingame, CA）装片。使用 Bio-Rad 2100 共聚焦显微镜和 60× 油镜对切片进行成像。 细胞表面标记的最佳条件为：25 μM alkyne-488、CuSO4（50 μM）、THPTA（250 μM）、氨基胍（1 mM）和抗坏血酸钠（2.5 mM），在 4 °C培养基中培养 1 至 5 分钟。

参考文献

1. Polytriazoles as Copper(I)-Stabilizing Ligands in Catalysis T. R. Chan, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. V. Fokin, Org. Lett. 2004, 6, 2858.

2. Analysis and Optimization of Copper-Catalyzed Azide–Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation V. Hong, S. I. Presolski, C. Ma, M. G. Finn, Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 9879. 

3. Stabilization of Virus-like Particles with Poly(2-oxazoline)s; F. Manzenrieder, R. Luxenhofer, M. Retzlaff, R. Jordan, M. G. Finn, Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 2601.

4. Synthesis of Cyclic Peptide Disulfide–PHPMA Conjugates via Sequential Active Ester Aminolysis and CuAAC Coupling; K. A. Günay, H. Klok, Polym. Chem. 2016, 7, 970.

5. a) Cellular Consequences of Copper Complexes used to Catalyze Bioorthogonal Click Reactions;D. C. Kennedy, C. S. McKay, M. C. B. Legault, D. C. Danielson, J. A. Blake, A. F. Pegoraro, A. Stolow, Z. Mester, J. P. Pezacki, J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 17993.;b) Labeling Live Cells by Copper-Catalyzed Alkyne−Azide Click Chemistry

6. Labeling Live Cells by Copper-Catalyzed Alkyne−Azide Click Chemistry; V. Hong, N. F. Steinmetz, M. Manchester, M. G. Finn, Bioconjugate Chem. 2010, 21, 1912.

7. Imaging Cell Surface Glycans with Bioorthogonal Chemical Reporters; Pamela V. Chang, Jennifer A. Prescher, Matthew J. Hangauer, and Carolyn R. Bertozzi; J Am Chem Soc. 2007 Jul 11; 129(27): 8400–8401.

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