外周成熟 B 细胞可以分为多个亚群.传统上根据表型、组织学定位和功能特点的不同将 B 细胞分为 CD5+的 B1 细胞和 CD5 的 B2 细胞两个亚群。B细胞主要功能是分泌抗体参与体液免疫。在一定情况下，B 细胞也可以分泌细胞因子，发挥免疫学调节作用，并根据分泌细胞因子的不同将 B 细胞分为不同效应功能的亚群，调节性 B 细胞通过产生负性调控因子 IL-10 发挥作用。

原理

B 细胞功能亚群的鉴定基本原理是利用多通道流式细胞仪检测同一器官中的不同 B 细胞亚群，对B细胞表型和功能进行鉴定。

操作方法

B细胞功能亚群的鉴定

材料与仪器

试剂：
（1）布雷菲德菌素 A（brefeldin A，BFA）或莫能霉素（monensin）。
（2）Fc 阻断剂。
（3）1x 磷酸盐缓冲液（1xPBS）。
（4）染色缓冲液（1xPBS＋0.1％BSA＋0.05％ 叠氮钠）。
（5）细胞固定液（4％多聚甲醛）。
（6）破膜液（1xPBS＋0.1％牛血清白蛋白＋0.05％叠氮钠＋0.1％皂苷）。
（7）含10％ FCS 的 RPMI 1640 培养液、含有5％FCS的PBS。
（8）荧光标记的 mAb。
仪器：
流式细胞仪

步骤

B细胞功能亚群鉴定的基本过程可分为以下几步：
（1）制备细胞悬液：用含 10％FCS 的 RPMI 1640 培养液重悬细胞，调整细胞浓度为 2x10⁶／ml，进行体外培养。
（2）细胞体外培养
1）具体刺激物的选择参见 B 细胞活化条件，或者用特异性抗原刺激细胞。
2）设置不加任何刺激剂的阴性对照组。
3）每个培养条件加阻断剂 BFA（检测IL——10时，用莫能霉素）。
4）37℃、5％CO₂ 培养箱中孵育 6 小时以上。
（3）荧光素抗体标记细胞：
1）表面分子标记：将0.5x10⁶——1x10⁶个细胞重悬于 100μl 的染色缓冲液中，在标记前加入 Fc 阻断剂（CD16／CD32），以防止Fc受体结合抗体；根据实验设计方案，加入足量的荧光素标记的表面分子抗体到细胞悬液中；4℃ 避光孵育30分钟；用染色缓冲液洗涤2次。
2）固定细胞：弃上清，加入 4％ 多聚甲醛，500μl／管，混匀，室温避光8分钟；用染色缓冲液洗涤2次。
3）破膜：弃上清，用破膜液重悬细胞（若只分析细胞表面分子，则无需进行固定破膜），200μl／管，4℃，放置至少2小时或者过夜；用染色缓冲液洗涤2次。
4）用染色缓冲液重悬细胞，100μl／管；根据实验设计，加入相应的染色抗体，混匀，4℃避光孵育30分钟；用染色缓冲液洗涤2次；弃上清，用150——200μl的洗液重悬，4℃避光放置，等待上机。
5）上流式细胞仪获取数据及分析数据。

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