伊文思蓝染色是的用途非常广泛，在小动物的活体实验中涉及到心血管系统、神经系统、骨骼肌系统等疾病的研究方法，这里我们主要介绍了伊文思蓝染色在检测血脑屏障通透性中的检测方法及应用。

原理

伊文思蓝是一种常用的偶氮染料制剂，与血浆白蛋白有很高的亲和力，在生理状态下，血浆白蛋白无法透过血脑屏障，与血浆白蛋白结合的依文思蓝无法使其着色。当神经系统血脑屏障被破坏时，伊文思蓝就可以进入神经系统并使其着色。伊文思蓝染料在荧光波长 470 与 540 nm 各有一强峰，其在组织中的含量常使用化学透析法和比色法进行检测。

伊文思蓝灌注染色法结合共聚焦激光扫描显微镜观察脑切片中伊文思蓝染料荧光强度，可以检测血脑屏障中血管形态的改变，同时对脑组织中渗入的伊文思蓝染料含量进行定量分析。

操作方法

伊文思蓝检测血脑屏障通透性

原理

伊文思蓝是一种常用的偶氮染料制剂，与血浆白蛋白有很高的亲和力，在生理状态下，血浆白蛋白无法透过血脑屏障，与血浆白蛋白结合的依文思蓝无法使其着色。当神经系统血脑屏障被破坏时，伊文思蓝就可以进入神经系统并使其着色。伊文思蓝染料在荧光波长 470 与 540 nm 各有一强峰，其在组织中的含量常使用化学透析法和比色法进行检测。伊文思蓝灌注染色法结合共聚焦激光扫描显微镜观察脑切片中伊文思蓝染料荧光强度，可以检测血脑屏障中血管形态的改变，同时对脑组织中渗入的伊文思蓝染料含量进行定量分析。

材料与仪器

待检测小动物（小鼠、大鼠等）、2% 伊文思蓝染液、麻醉剂、0.9% 氯化钠溶液、肝素、1 mL 注射器、眼科剪、镊子。

步骤

伊文思蓝检测血脑屏障通透性的步骤如下：

1、配制 2% 的伊文思蓝染液（2 g + 100 mL 双蒸水）、含有 20 U/mL 肝素的氯化钠溶液备用。

2、用麻醉剂麻醉小鼠（这里麻醉剂不做推荐，根据小鼠体重选择合适的剂量）。

3、从尾静脉或股静脉注射 2% 的伊文思蓝染液（2 mL/kg）。

4、打开小鼠胸腔，从心尖部缓慢注入 0.9 氯化钠溶液（含肝素），剪开右心房，直到右心房中流出的液体澄清，停止灌注。

5、分离脑组织，若有明显着色，可直接用体式显微镜进行拍照

6、进行大体拍照后，可根据情况和需求将脑组织进行切割，用于制备冰冻切片进行共聚焦拍照，或匀浆后取上清在 620 nm 处进行分光光度计测量。

J Control Release. 2015 May 28;206:49-57. doi: 10.1016/j.jconrel.2015.02.027. Epub 2015 Feb 25. 图中Camera为体式显微镜下的拍照图，Epifluorescence Microscopy为荧光显微镜下的拍照图。

注意事项

1. 伊文思蓝染液最好提前计算好用量，现配现用。

2. 统计分析时，分光光度计所测数值为吸光度，若想进一步定量需要提前制备标准品，构建标准曲线进行定量分析。

3. 共聚焦拍摄的荧光图片可通过 imageJ 进行相对定量分析。

常见问题

1. 尾静脉注射伊文思蓝染液不容易成功怎么办？

如果尾静脉注射不熟练，这时候可以通过小鼠的股静脉或颈静脉进行注射。

2. 脑组织（有血脑屏障受损）大体染色效果不明显（组织上没有肉眼可见的蓝色）是否意味着实验失败？

这时先不要着急，虽然脑组织上没有明显的蓝色，但不一定意味着实验的失败，可以将组织进行匀浆后，取上清通过吸光光度计进行进一步的定量分析。

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