简介

蓝白斑筛选是一种常用且高效的分子生物学技术，常用于克隆实验中筛选重组菌株。该技术核心在于 β-半乳糖苷酶（β-galactosidase） 的酶促活性。β-半乳糖苷酶是一种四聚体酶，由大肠杆菌中的 lacZ α 基因 编码，能够分解乳糖生成葡萄糖和半乳糖。除此之外，β-半乳糖苷酶还可以水解另一种底物 X-Gal，生成 5-溴-4-氯-靛酚（5-bromo-4-chloro-indoxyl），随后二聚形成蓝色产物。

α-互补现象（α-complementation） 使 β-半乳糖苷酶成为一个强大的分子克隆工具。在此过程中，宿主菌中的 lacZ ω 基因 存在缺失，导致 β-半乳糖苷酶失活。当质粒携带缺失的 α 片段转化进入此类菌株后，功能性 β-半乳糖苷酶可被重新形成。​在克隆实验中，质粒通常含有 lacZ α 基因片段，而宿主菌株带有 lacZ ω 缺失突变。因此，在转化过程中，若菌株获得带有 α 片段的质粒，就能恢复 β-半乳糖苷酶功能。然而，如果质粒中插入了目的 DNA，并打断了 α 片段，则无法形成功能性 β-半乳糖苷酶，产生的便是重组菌株。

为了进行蓝白斑筛选，在转化后培养基中加入 X-Gal 及 IPTG（异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷），后者用于诱导 lacZ 基因表达。

· 蓝色菌落 表示产生了功能性 β-半乳糖苷酶，即未插入目的 DNA。

· 白色菌落 表示酶功能受抑，X-Gal 不能被水解为蓝色产物，说明质粒中含有插入的目的 DNA，应选取这些白色菌落（见图 1）。

本文提供一套高效筛选重组菌的蓝白斑筛选实验操作流程。

材料准备

· X-Gal（Aladdin 货号：X274331）

· 二甲基甲酰胺（DMF）（Aladdin 货号：D111999 等）

· 无菌去离子水（dH₂O）

· IPTG（Aladdin 货号：I274316、I104812）

· 适当的筛选抗生素

· 琼脂培养基（可选）

· 平板培养皿

方法

X-Gal 和 IPTG 的准备

X-Gal 与 IPTG 可在倒板前加入培养基，也可滴加在已制好的平板表面。

1. 配制 20 mg/ml X-Gal 溶液于 DMF 中

o 储存于聚丙烯或玻璃管中，避光，–20 °C，稳定期为 6–12 个月。建议分装成 1 ml，以减少反复操作对稳定性的影响。

o 若担心 DMF 对细胞的毒性，可配制 100 mg/ml 的高浓度 X-Gal 溶液，减少体积加入，但此溶液在 –20 °C 下仅稳定 1 周。

2. 配制 100 mM IPTG 溶液（可用 1M IPTG 稀释）

o 建议分装（1 ml）后 –20°C 保存，有效期为 1 年。

在含 IPTG 和 X-Gal 的琼脂培养基上筛选（推荐）

1. 将培养基高压灭菌后冷却至约 50 °C。

2. 每 1 ml 培养基中加入以下任一比例：

o 10 µl 的 20 mg/ml X-Gal

o 或 2 µl 的 100 mg/ml X-Gal

注：建议使用更高浓度的 X-Gal 可增强蓝色信号，减少模糊菌落，并缩短显色及冷藏时间。

3. 每 1 ml 培养基中加入 10 µl 100 mM IPTG（最终浓度为 1 mM）。

4. 加入适量筛选抗生素。

5. 倒板后放置至室温冷却凝固（约 30 分钟）。

6. 均匀铺板转化后的感受态细胞。

注：蓝白斑筛选平板若存放于 4°C 的透明袋中，一般稳定期为 1 周。若避光保存（如用黑袋或避光环境），可延长至 1 个月。

在无 IPTG/X-Gal 的已制平板上筛选

1. 倒入已高压灭菌、含抗生素的培养基，置于超净工作台中晾干。

2. 每个平板表面加入：

o 40 µl 100 mM IPTG

o 120 µl 20 mg/ml X-Gal​并在整个表面均匀涂布。

注：平板边缘不易均匀涂布，可能出现假阳性。建议优先挑取中间区域的菌落。

3. 在超净台中晾干 30 分钟。

4. 铺板转化菌，倒置培养，37°C 过夜，等待蓝色菌落显色（约 24 小时）。

References

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