BMDC（骨髓来源的树突状细胞）的分离和培养是免疫学研究中的一项重要技术。本篇实验方案将对如何从小鼠中分离未成熟的骨髓来源的树突状细胞展开介绍。

操作步骤

       确保步骤1-6中的所有试剂和样品都保存在冰上，可以尽量保持细胞活力。同时为了保持无菌状态，请在层流罩内使用无菌器具执行所有步骤。

1.切开髋关节上方的后腿以便接触股骨和胫骨，保留膝盖和踝关节。使用无菌擦拭纸，如KimwipesTM，擦拭以清除肌肉和组织上的伤痕。一般股骨的骨髓往往比胫骨的多。

       注意：只能使用完整的骨头，因为如果骨头断裂，骨髓就不会是无菌的。

2.在培养皿中倒入70%乙醇，将清洗过的骨头浸入其中5-10秒钟，以对其外部进行消毒，然后将其放在冰上的无菌管中，直到所有骨头都被冲洗干净。

       注意：冲洗每根骨头时可以将骨头留在乙醇中更长时间，但同时也要注意避免太长时间浸泡，不然乙醇会浸入骨头并杀死活细胞。

3.在层流罩内使用无菌器具，用剪刀剪断骨头的两端，注意尽量靠近关节处。然后用注射器吸满冰冷的RPMI完全培养基（R10），将注射器针头插入骨头并将骨髓冲洗到置于冰上的离心管中。

4.冲洗2 - 3次，直到骨头完全变白。再通过移液枪吹打溶解所有簇状物。

5.在R10培养基中以1,500 rpm的速度离心1 - 2次，每次5分钟。

6.用R10培养基重悬细胞沉淀物，并使用血细胞计数器和台盼蓝染色对活细胞计数。

7.将细胞稀释到10 mL R10 + 20 ng/mL GM-CSF中。然后将细胞转移到培养皿中，密度为每板2×106个活细胞。

8.将培养皿放入含有5%二氧化碳的37°C培养箱中。

9.第3天，另外添加10 mL R10 + 20 ng/mL GM-CSF。

       注意：非常轻柔地添加培养基以免扰乱正在生长的细胞。

10.在第6天，取出一半培养基（10毫升）。

       注意：非常轻柔地去除培养基以免扰乱正在生长的细胞。

11.取出的培养基进行短暂离心。再用10 mL新鲜R10 + 20 ng/mL GM-CSF重新悬浮细胞沉淀，并将其添加回原始培养物中。

       注意：可以在第8天收获细胞，或者重复第11步以在第9天或第10天收获细胞。

       由于树突状细胞（DC）粘附性较差，因此应仅对细胞进行短暂离心。

12.可以用PBS温和清洗培养上清液中的非贴壁细胞和松散贴壁细胞，然后汇集起来用于后续实验。

       警告：避免在此处使用 EDTA，因为这会去除粘附的巨噬细胞，稀释您的DC样本。

       提示：大多数粘附细胞为巨噬细胞，而悬浮或松散粘附的细胞为树突状细胞（DC）和F4/80+巨噬细胞。为了获得高纯度级分，建议采取措施消耗F4/80+细胞并富集CD11c+细胞群。

       悬浮液中的大多数巨噬细胞会同时表达F4/80+和CD11c。F4/80+细胞可通过抗 F4/80磁珠的正向选择去除。在此步骤之后，可使用抗CD11c磁珠从流出液中正向选择CD11c+ DC。

13.未成熟的DC可以在纯化后立即使用，或者如果您希望获得成熟细胞，可以进行进一步培养。

       提示：DC的粘附性较松散，只需粘附在培养皿上即可成熟，因此可以使用未经组织培养处理的96孔U型底板来防止过早成熟。

14.纯度评估。建议对细胞进行流式细胞术检查其纯度。还可以加入纯度检查试剂来标记仍与磁珠结合的细胞。

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