本实验来源第四军医大学官方网站

操作方法

Calcein释放实验检测细胞毒性T淋巴细胞活性实验

原理

Calcein acetoxymethy1酯（Calcein-AM）是一种胞浆荧光标记物，本身无荧光，渗入细胞后细胞内酯酶催化生成的水溶性绿色荧光物质不易透出细胞。靶细胞用其标记后与效应细胞共育，再加Fluoro-Quench试剂（一种以Ca2+螯合的小牛血红蛋白主要成分、还含溴化乙啶试剂，它对细胞无毒，不能进入活细胞但可能进入膜已破损的死细胞），淬灭培养液中的荧光，在板式荧光扫描仪上定量测定活细胞内的荧光强度，与靶细胞对照孔（代表细胞100%存活）比较。即可计算效应细胞杀伤靶细胞百分比。本法简便可靠，无须收集和转移培养上清，重复性高，变异性小，测定数据自动输入计算机，适于大批量测定；可测CTL、LAK及NK细胞活性，还可在光学显微镜或荧光显微镜下直接观察细胞。

步骤

1． 靶细胞的标记　   用5μmol/L Calcein AM 37℃ 水浴30min进行标记。   2． 效-靶细胞作用　   杀伤实验在圆底96孔培养板中进行。按E/T比例：50/1、25/1、12.5/1、6.25/1、3.13/1、1.56/1加入梯度稀释的效应细胞与标记好的靶细胞各l00μl/孔，每个比例3复孔。同时设自发释放组3复孔，完全释放组3复孔。效-靶细胞作用96孔培养板在37℃ 5％ CO2培养箱孵育4h后，3000r/min离心5min，将上清移入新的孔中。   3． 荧光检测　

用荧光测量仪检测上清的荧光值(FI)，激发光为485nm，发射光为538nm。   4． 结果计算   杀伤率(％)=■×100%

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