1.实验原理

CCK-8全称Cell Counting Kit-8，是一种基于WST-8的细胞活性检测试剂，常用于细胞增殖与细胞毒性评价。其核心原理是：在电子传递介体存在的条件下，可溶性的四唑盐WST-8被细胞线粒体内的脱氢酶还原，生成一种橙黄色的甲臜类产物（formazan）。这种产物可溶于培养基中，其颜色深浅与细胞内酶活性密切相关，从而间接反映细胞数量和存活状态。

当细胞增殖良好、代谢活跃时，产生的formazan较多，450 nm波长下的吸光度（OD值）升高；当细胞受到药物或其他因素损伤甚至死亡时，线粒体脱氢酶活性下降，所形成的formazan减少，对应的OD值变小。因此，CCK-8实验可以通过比较不同处理组与对照组的OD值变化，定量评估药物或处理条件对细胞增殖和毒性的影响。

2.实验步骤

（1）制备细胞悬液，计数：

若为悬浮细胞则直接离心收集对数生长期的细胞；若为贴壁细胞则用胰酶消化后离心收集细胞。将收集到的细胞用含血清培养基重悬后，用血细胞计数板计数，再稀释为5*10³~5*10⁴个/ml的单细胞悬液。

（2）细胞接种：

在96孔板中接种细胞悬液，每孔100μl，同时设计不同的浓度组，每个浓度组可设计3~6个复孔，且设置好空自组和对照组。

（3）加药处理及孵育：

将培养板放入培养箱中预培养24h左右（37℃，5%CO₂）。待细胞贴壁效果良好后，吸出培养基，向培养板各孔中加入不同浓度的待测物质（药物、化学试剂等）放入培养箱中孵育6~96h。

（4）CCK-8孵育：

向每孔中加入10μl CCK-8溶液，加完试剂后轻轻晃动培养板以帮助混匀（防止因CCK8试剂沾在孔壁上而带来误差），加样的过程中尽量不要产生气泡，以免影响OD值读数。将培养板放入培养箱中孵育1~4h。

（5）测定吸光度OD值：

用酶标仪测定450nm处的吸光度（OD）。

3.数据处理

（1）计算细胞存活率的公式如下：

细胞存活率=（实验孔的OD值-空白孔的OD值）/（对照孔的OD值-空白孔的OD值）*100%

（2）计算细胞抑制率的公式如下：

细胞抑制率=（空白孔的OD值-实验孔的OD值）/（空白孔的OD值-对照孔的OD值）*100%

4.常见问答

Q1：为什么同一组复孔之间的OD值差异很大？

A：这种情况最常见的原因包括细胞接种不均匀（细胞悬液没有充分吹匀、边加边沉降）、细胞状态不一致（有的孔细胞未贴壁或部分脱落）、边缘孔蒸发导致体积变化，以及加CCK-8时产生大量气泡。建议在接种前充分吹打混匀细胞悬液，尽量使用中间孔作为实验孔；加样后轻轻拍打或摇晃96孔板帮助细胞均匀分布；使用移液枪加CCK-8时贴壁缓慢加样，避免气泡，并尽量保证每组至少3–6个复孔以平滑误差。

Q2：显色太弱，OD值很低怎么办？

A：首先确认接种细胞数是否足够、细胞是否处于良好增殖状态（对数生长期），其次检查显色时间是否偏短。如果对照组OD值始终偏低，可以适当提高接种密度或延长孵育时间，比如将显色时间从1–2 h延长到3–4 h；对于血液细胞等代谢略慢的细胞类型，显色5–6 h也很常见。如果延长显色后仍然很低，要排查培养基、血清、CCK-8试剂是否失效或储存条件不当。

Q3：显色太深，OD值接近或大于2.0可以用吗？

A：一般建议把对照组扣除空白后的OD值控制在1–2之间，这个范围内线性关系较好，便于后续定量分析。如果OD值明显大于2，说明细胞密度或显色时间过长，已经接近饱和区，得到的存活率/抑制率曲线可能不够准确。解决方法是适当降低接种细胞数，或者缩短CCK-8孵育时间，并在预实验中通过多时间点测定找到一个合适的“固定显色时间”。

Q4：药物本身有颜色或在450 nm有吸收怎么办？

A：此时一定要设置“药物空白”：即只含药物+培养基+CCK-8，不含细胞的孔，测得的OD代表药物与试剂和培养基之间的本底吸收。后续计算时，实验孔和对照孔的OD值都要扣除相应的空白值，才能避免把药物颜色当成细胞信号。如果药物颜色非常深、在450 nm有强吸收，且空白扣除仍不能解决问题，则需要考虑改用其他检测方法或波长。

Q5：CCK-8对细胞有毒性吗？可以多次重复测定吗？

A：在推荐浓度下，CCK-8对大多数细胞毒性较低，短时间孵育通常不会显著影响细胞活性。但由于显色过程本身依赖线粒体酶反应，多次重复加CCK-8和长时间孵育都有可能逐渐改变细胞状态，对后续实验造成干扰。因此，不建议在同一批细胞上多轮反复加CCK-8测定，一般都是一次加染后直接读终点数据。如果确实需要动态监测，最好为每个时间点单独准备对应的板。

Q6：悬浮细胞做CCK-8有什么特别要注意的吗？

A：悬浮细胞最关键的是防止细胞沉降不均和在操作过程中被吸走。接种前应充分吹打混匀，尽量快速地完成整板加样；孵育过程中，避免频繁移动培养板；在加CCK-8或处理上清时，移液枪头不要过分深入孔底，以免把细胞一起吸出。有条件的话，可以在孵育前轻轻离心几秒，让细胞稍微沉到底部，有助于信号稳定，但离心力不宜过大，以免影响细胞状态。

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