细胞冻存是指利用加入保护剂的冻存液将细胞冻存于-175℃ 液氮中。目前常用的保护剂有二甲基亚砜（DMSO）和甘油，保护剂要求对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞，使用浓度范围在 5％-15％ 之间，常用浓度为 10％。DMSO 本身有毒，无需过滤或高压灭菌，而冻存液可以过滤除菌。

原理

细胞冻存实验的基本原理是细胞冻存于-175℃ 液氮中，如果不加任何条件直接冻存细胞，细胞内外环境中的水会形成冰晶，导致细胞内发生一系列变化，如机械性损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH 改变及蛋白质变性等，最终导致细胞死亡。

如果冻存液中加入保护剂，可使冰点降低，在缓慢冻结的条件下，能使细胞内水分在冻结前渗出细胞外。-130℃ 以下低温贮存能减少冰晶形成。

操作方法

细胞冻存保种

原理

传统上的细胞冻存（甘油/二甲基亚砜做保护剂）讲求的是：慢冻速溶。细胞冻存时向培养基中加入的甘油或二甲基亚砜（DMSO），这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。

材料与仪器

【实验材料】
细胞、DMSO、0.25% Trypsin-EDTA（或细胞刮刀）、100X 双抗、PBS、胎牛血清、DMEM 完全培养基、75% 乙醇、胰酶、异丙醇；
【仪器与用品】
冻存管、37 ℃ 恒温水浴锅、培养皿（6 cm）、细胞冻存盒（已添加异丙醇）或冻存泡沫盒、记号笔、-80 ℃ 冰箱、倒置相差显微镜、液氮罐、离心机、细胞房专用超净台、移液枪及移液枪头（无菌或灭菌后烘干）、一次性细胞计数板、细胞自动计数仪、培养箱、移液管。

步骤

1. 预先配制冻存液：按正常培养基:DMSO = 9:1 比列配制冻存液;

2. 取对数生长期细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，离心 1000 rpm，5 min；

3. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为 5×10⁶/mL～1×10⁷/mL；

4. 将细胞分装入冻存管中，每管 1～1.5 ml；

5. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间、细胞代数及操作者；

6. 往冻存盒中加入异丙醇（在负八十冰箱中能以 1 ℃/min 的速度下降）放入 -80 ℃ 冰箱即可，建议 12 小时以上。一般可在  -80℃ 中保存半年至一年，长期保存要转移至液氮中；商用冻存液可以直接冻存管放 -80 ℃ 冰箱。

注意事项

1. 液氮冻存不建议用国产冻存管，复苏时容易爆管；2. 消化细胞时，不能过度消化；3. DMSO 溶于 DMEM 培养基会放热，应提前 5-10 分钟配置冻存液。用冻存盒时避免异丙醇将标记擦掉；4. DMSO 能穿透许多合成的或天然的膜，包括皮肤和橡胶手套。因此，应谨慎处理。将冻存管放入液氮时，必须使用保护性手套和面罩。

常见问题

1. 细胞消化过度，导致复苏时细胞状态不好；

2. -80 ℃ 冰箱中长期保存细胞效果不好，应及时将细胞转移至液氮中；

3. 国产冻存管在液氮中容易漏液氮，导致复苏时曝管，所以放液氮中尽量使用质量较好的冻存管。

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