在悬浮或单层培养细胞体系中融合细胞，用 PEG 处理细胞的时间应很短，以减少细胞的死亡。通常，在使用选择性培养基前，需给细胞 24 h 的恢复期。

操作方法

方案27.10细胞杂交

材料与仪器

PEG
完全培养基 无血清培养基 NaOH
皮氏培养皿 通用容器

步骤

PEG 1000 ( Merck)：

(a) 髙压处理PEG，将其液化及灭菌。

(b) 将 PEG 冷却到 37°C ，然后与预热至 37°C 的等体积无血清培养基混合。

(c) 用 1.0 mol/L NaOH 调整 pH 至约 7.6~7.9。

(d) 溶液于 4°C 储存最长为2 周。

A. 单层培养细胞的融合：

1. 将两种等量待融合的细胞分别接种于 50 mm 细胞培养皿。每个亲代细胞系接种浓度在 2.5X10⁵~2.5X 10⁶ /皿之间即可。

2. 将混合的细胞过夜培养。

3. 将 PEG-无血清培养基加温至 37°C ，此时需要用 NaOH 重新调定 pH。

4. 弃净原培养液，用无血清培养基洗涤细胞一次。

5. 加入 3.0 ml PEG 溶液，使其覆盖单层细胞。

6. 精确计时 1 min，之后弃去 PEG，用 10 ml 无血清培养基洗涤单层细胞，改换完全培养基。

7. 过夜培养细胞。

8. 再加入选择性培养基。

B. 悬浮培养细胞的融合：

9. 将两种亲代细胞混合（各为 4X10⁶ 个细胞），室温、150g 离心 5 min。后续离心和融合过程均在 30 ml 的塑料通用容器或离心管中进行。

10. 用 15 ml 无血清培养基将沉淀制成悬浮液，再次离心。

11. 吸去所有的培养基。

12. 用吸管小心加入 1 ml PEG 溶液，轻轻吹打，悬浮细胞。

13. 1 min 后，用 9 ml 无血淸培养基将细胞悬液稀释，将其等分到 2 个通用容器或 1 个预盛 15 ml 无血清培养基的离心管中。

14. 以 150 g 离心 5 min，弃去上清，用完全培养基再次悬浮细胞。

15. 37°C 过夜培养。

16. 在选择性培养基中克隆细胞。

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