方 法

通过二硫键连接肽和 PNA

1.称 量 0.5〜2 mg 肽 和 Imol PNA 分别装入不同的离心管中。

2•用 2 〇 0ul去氧 DMSO 溶 解 PNA。如果不能溶解， 55°C 温 浴 5 min，如果还没有溶解,可使用该悬浮液继续实验。

3•在 IOOm 10. Olm 〇 l/L 乙酸缓冲液中溶解肽（pH 5. 5)。

4 . 在每个溶液中都加入 200ul DMF (推荐）或 DMSO。

5•混合两个溶液并充分振荡。如 果 PNA 仍然没有溶解，1oooog (桌面离心机的最大速度） 离心 2 min，吸取 5〜3 〇ulTFA 加 入（取决于沉淀大小）， 20s 后振荡重悬。如果没有 TFA 可以用 6mol/L 盐酸胍或 7mol/L 尿素替代。

另外，还可以将两个赖氨酸连接到羧基端和氨基端来提高 PNA 溶解度。这样二硫键形成可以在 0.01mol/L 乙酸缓冲液和乙腈溶液（50/50) 中进行。

6•室温振荡或搅拌 2 h 或过夜。避免直接见光。

7•半制备反相-HPLC 分离反应产物。

a. 梯度取决于肽的疏水性。对于疏水蛋白，使用等度 2 0 % 洗 液 B 5 min，然后使用梯度增加到 1 0 0 % 的洗液 B 40 min;

富含精氨酸和赖氨酸的肽的 HPLC 曲线类似于 PNA 寡聚体，使得有效的分离很难。可以尝试从 0 % 洗液 B 60 min 增加到 8 0 % B。

b•检测波长为 218nm，肽带的最大吸收值为 260nm，指 示 PN A 核酸碱基。使用260nm 进行单一波长检测。

8•收集吸收两个波长的色谱峰

9.冻干样品储存于一 2 〇°C 暗处，避免反复冻融。应用质谱仪分析接合物确定正确的产物。

将 CPP-S^S^P N A 接合物传送到细胞中进行反义应用

10.至少在实验前一天，接种表达目的蛋白的细胞系，使得实验当天细胞汇合度达到4 0 % 〜6 0 % 。需 要 6 个 孔（两个平行反义实验，两个用于控制 P N A ，两个对照不进行操作）。

11.将培养基换为新鲜的无血清培养基。

12.制 备 新 鲜 的 〇.l m m 〇 l/L C P P -S S ^ N A 接 合 物 或 解 冻 一 块 以 前 制 备 的 接 合 物(一 20°C 保存）。

制备从 O .lmmol/L 到 5umol/L 的一系列稀释液，估算低浓度下的反义效应。这需要比本实验中列出的更多的细胞和接合物。

13.55°C 加热 C P P -S ^ P N A 溶液 lm i n。

14.在细胞培养孔中，每 I m l 培 养 基 加 入 10ul 0.1m m 〇 l/L 的 C P P -S——S——P N A 溶液，C P P -S ^ P N A 最终浓度为 lumol/L 。

15.37°C 培 养 3 h ，然后换到完全培养基中。

16.37°C 培养至少靶标蛋白质半衰期的 2 倍时长。

17.收集细胞，用适当方法测定蛋白质的量。

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