铜依赖性细胞死亡是一种新形式的细胞死亡方式，被定义为非凋亡性细胞死亡途径。在健康的细胞中，铜离子通过铜转运蛋白进入细胞内，同时通过线粒体中的氧化还原酶等参与氧化-磷酸化反应，完成细胞代谢过程。

但是当细胞内铜离子浓度过高，或者铜转运蛋白、氧化还原酶等出现缺失时，过量铜离子就会在细胞内累积，诱导氧化应激、细胞膜 DNA 损坏、从而影响细胞的正常功能，最终导致细胞死亡。

原理

铜直接与三羧酸（TCA）循环的脂酰化组分相结合。然后，这些铜结合的脂化线粒体蛋白发生聚集和 Fe-S 簇蛋白降解触发了蛋白水毒性应激，最终导致细胞死亡。

操作方法

细胞铜死亡的检测

原理

铜直接与三羧酸（TCA）循环的脂酰化组分相结合。然后，这些铜结合的脂化线粒体蛋白发生聚集和 Fe-S 簇蛋白降解触发了蛋白水毒性应激，最终导致细胞死亡。

材料与仪器

试剂：DMEM 培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素、Disulfiram（DSF）、0.25% 胰酶（含 EDTA）、磷酸盐缓冲液（PBS）、CuCl2 溶液、抗体（FDX1、DLAT、DLST、LIAS、caspase 3、caspase 9、GAPDH 和 HRP）、DAPI 染料、SDS-PAGE 凝胶

步骤

1、将细胞放置在含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM 培养基中生长；

2、取对数生长期的细胞，用 0.25% 胰酶消化后收集细胞，用 PBS 重新悬浮调整细胞浓度为 2 × 10³ 个/孔接种于 96 孔板中；

3、提前 30 分钟在培养中加入 1 µM 的 CuCl₂ 溶液，再在每孔中加入 0.05~1.6 μM 的 DSF 处理细胞，并设置空白对照组（即不添加 CuCl₂ 的 DSF 处理组），置于于 37 ℃、5% CO₂ 培养箱中培养；

4、在处理细胞 16~24 小时后，重复三次加入 0.05~1.6 μM 的 DSF，72 小时后通过试剂盒测定细胞活力，并在显微镜下观察；

5、将步骤 3 的处理组细胞用 DSF 处理 2 小时后用 PBS 洗涤，用 10% 福尔马林重悬，在室温下孵育固定；

6、使用 FDX1 抗体作为一抗孵育细胞，用 PBS 洗去多余的一抗后加入荧光标记的二抗，再用 PBS 缓冲液对细胞进行洗涤，使用核染色剂（DAPI）对样品进行染色于显微镜下观察；

7、同样将 DSF 处理 2 小时后的细胞加入蛋白酶抑制剂进行裂解，洗脱蛋白至 SDS-PAGE 凝胶中进行电泳分离，然后转移至聚丙烯酰胺薄膜中，转膜封闭后加入一抗（FDX1、DLAT、DLST、LIAS、caspase 3、caspase 9、GAPDH）于 4 ℃ 孵育过夜，然后加入二抗 HRP 室温摇床孵育 2 小时，洗涤后置于发光成像分析系统中观察。

注意事项

（1）细胞的培养条件需要严格控制，温度、湿度、CO2浓度、培养基配方以确保实验结果的可重复性；

（2）铜离子浓度和处理时间要控制，过高的浓度和长时间的处理都会导致不必要的毒性和干扰，影响实验结果；

（3）用铜离子载体药物 DSF 处理时采用电脉冲，避免因药物诱导癌细胞凋亡和产生氧化应激；

（4）细胞在固定过程中避免因额外压力或其他因素造成细胞形态和结构的改变，从而影响实验结果。染色试剂的选择应基于具体情况进行优化和调整，并注意染色试剂与细胞样本的兼容性；

（5）蛋白检测指标中，重点观察 Fe-S 蛋白的变化，而凋亡相关蛋白的含量不会发生变化，若凋亡相关蛋白有明显变化应该考虑实验过程中的操作方法是否有误。

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