原理

细胞 DNA 链断裂时，DNA 的超螺旋结构受到破坏，在中性条件时，DNA 片段可进入凝胶发生迁移，而在碱处理和碱性电解质的作用下，DNA 发生解螺旋，损伤的 DNA 断链及片段被释放出来，由于这些 DNA 的分子量很小，所以在电泳过程中会离开核 DNA 向阳极移动，形成彗星状的拖尾图像，而未损伤的 DNA 部分停留在原位，染色后成圆形荧光团。

应用

评价单个细胞的 DNA 损伤（各种因素的生物反应、肿瘤的研究治疗预测）。

操作方法

单细胞凝胶电泳实验

原理

细胞 DNA 链断裂时，DNA 的超螺旋结构受到破坏，在中性条件时，DNA 片段可进入凝胶发生迁移，而在碱处理和碱性电解质的作用下，DNA 发生解螺旋，损伤的 DNA 断链及片段被释放出来，由于这些 DNA 的分子量很小，所以在电泳过程中会离开核 DNA 向阳极移动，形成彗星状的拖尾图像，而未损伤的 DNA 部分停留在原位，染色后成圆形荧光团。

材料与仪器

【试剂】低熔点琼脂糖、正常熔点琼脂糖
PBS、TBE（5X）、溴化乙锭（EB）
Tris-HCl 溶液、RIPA 细胞裂解液
载玻片、盖玻片
【设备】荧光显微镜、核酸电泳仪

步骤

1、单细胞悬液制备

用胰酶将细胞消化至离心管中并进行细胞计数，用 PBS 调节细胞密度至 10⁵~10⁶ 个/ml。

第一层使用 80 μl 0.5% 正常熔点琼脂糖滴到预热的载玻片上，迅速盖上干净的盖玻片，4 ℃ 放置 10 min 使其凝固。

第二层是低熔点琼脂糖与细胞的混合液，取 10 μl 含 10000 个细胞的 PBS 和 75 μl 0.5% 低熔点琼脂糖在 37 ℃ 混匀，然后轻轻揭去盖玻片，将含细胞的低熔点琼脂糖滴到第一层胶板上，立即盖上干净的盖玻片，4 ℃ 放置 10 min 使其凝固。

第三层胶制备同第一层胶一致，盖上盖玻片。

移去盖玻片，将载玻片浸入新配置的 RIPA 细胞裂解液中至少裂解 2.5 h（尽量使每张玻片裂解时间相同）。此步骤的目的是裂解液由去垢剂及高盐溶液组成，除去溶解细胞膜及核膜，除去蛋白质、RNA 等，仅存留核骨架。

细胞裂解后，取出载玻片，用 PBS 冲洗 2 次，然后将载玻片置于水平电泳槽中，倒入 1XTBE 电泳缓冲液，覆胶面 0.25 cm，碱解旋 20 min，4 ℃ 冰箱中电泳 25~30 min，电压 25 V。

将载玻片取出，滤纸吸干电泳缓冲液，用 Tris-HCl（pH 7.5）中和 15 min。然后每片载玻片上滴加 50 μl 30 μg/mL 的溴化乙锭（EB）溶液，避光操作，盖上盖玻片，避光染色 20 min，即可观察。

EB 染色后的样本尽快在荧光显微镜下观察并拍照电泳图谱。

注意事项

1、细胞消化不彻底，没有得到单个细胞，多个细胞发生粘连。

2、尾巴形状不完全或者发生扭曲。

3、裂解液处理是本实验的关键，裂解液要澄清且完全溶解，裂解不彻底要延长裂解时间或考虑使用强裂解液。

4、溴化乙锭是剧毒物质，需做好防护，可考虑用其他核酸染料替代。

常见问题

问题1：细胞消化不彻底，没有得到单个细胞，多个细胞发生粘连。

答：细胞消化过程在孵箱中进行消化，可以用移液枪轻轻吹吸。

问题2：尾巴不完整或者发生扭曲。

答：制胶过程细致小心，不要产生气泡、胶面平整。剥胶过程小心细致。电泳保持在低电压且电压平稳，在 4 ℃ 冰箱里电泳。

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