化学发光（chemiluminescence，CL）是指伴随化学反应过程所产生的光辐射现象，大多数化学发光是以 O2 和 H2O2 作为氧化剂的氧化反应发光。化学发光反应包括两个关键步骤，即化学激发和发光，化学激发需提供足够的化学能，激发化学发光剂在吸收能量后跃迁至电子激发态，而当返回较低能级基态时有足够的发光量子产率。目前，用于化学发光免疫分析实验的方法主要有 3 种：化学发光酶免疫分析、化学发光标记免疫分析和电化学发光免疫分析。

原理

化学发光免疫分析实验的基本原理是将酶或化学发光物质标记抗原或抗体，免疫反应后通过加入酶促反应的发光底物（前者）或发光启动剂如碱性 H2O2 溶液（后者）发生化学发光反应，化学发光检测仪通过光电倍增管（PMT）分析接受光量子产量，以光信号强度显示抗原-抗体反应结果。具有灵敏度高、线性范围宽、仪器简单和易于自动化等优点。

操作方法

化学发光酶免疫分析

原理

化学发光酶免疫分析的基本原理是基于酶联免疫分析方法基础上的检测方法，操作步骤与 ELISA 相同，竞争法测定小分子抗原物质，双抗体夹心法测定大分子抗原物质，以及间接法检测抗体等。CLEIA 不同于 ELISA 之处，在于酶的催化底物是化学发光剂，产生化学发光，产生的光信号强度通过化学发光信号检测仪来检测，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，较分光光度法检测灵敏度更高，线性范围更宽。

材料与仪器

器材：
① 微板型化学发光分析仪（MPL1 MicroplateLuminometer)
② 鼠抗人 TSHa 亚基单克隆抗体预包被板 (luminescence-grade)
试剂：
① HRP 标记羊抗人 TSHβ 亚基 mAb（HRP-TSHg mAb)
② TSH 标准品（0～20 μIU/ml）
③ 洗涤液（0.05％ Tween20/PBS，pH7.4）
④ 化学发光底物 A 液和 B 液

步骤

化学发光酶免疫分析的基本过程可分为如下几步：

A. 准备

自 2～8 ℃ 冰箱取出试剂以及抗体预包被板条。

B. 加样

样品和标准品分别定位于相应孔，每孔加样 50 μl，再于各孔加 HRP-TSHs mAb 100 μl，充分混匀，室温孵育 60 分钟。

C. 洗板

倾倒板孔中的反应液，各孔加入洗液约 300 μl，静置 20 秒左右，除去其中液体，将板中液体拍尽，如此洗 4 次。

使用前取等量化学发光底物 A 液和 B 液，混匀后每孔加 100 μl。

在加发光底物液后的第 5～20 分钟测定各孔的发光强度（RLU）。

注意事项

1. 在无催化剂的情况下，鲁米诺与过氧化氢可发生缓慢的化学发光反应，造成一定的背景发光。因此，需分开保存，使用前混匀。

2. HRP-鲁米诺-H2O2-增强剂发光体系发出波长为 425 nm 的蓝光，发光强度（RLU）随时间而变化，应于第 5～20 分钟完成对各加样品孔的发光强度测定。

3. 清洗步骤需彻底，防止孔中气泡影响检测结果的准确性，导致假阳性。

4. 手工加发光底物的加样器吸量应准确，在加发光底物的过程中应避免加样器吸头与板孔或手指接触，以防止底物受到污染，同时不能有气泡。

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