减毒的复制缺陷痘苗病毒 Ankara（MVA），作为标准痘苗病毒株的替代物，可以作为载体表达外源蛋白。MVA 是痘苗病毒 Ankara 在鸡胚成纤维细胞中通过多次传代（>570 次）得到的。尽管MVA可以高效表达重组蛋白，但其在人类和大部分哺乳动物细胞中不能包装成具有感染能力的病毒颗粒，因此需制备专门用于培养 MVA 的鸡胚成纤维细胞。本实验主要介绍鸡胚成纤维细胞的制备。内容来源于《精编分子生物学实验指南（第五版）》

操作方法

基本方案

原理

用鸡胚制备培养鸡胚成纤维细胞。

材料与仪器

9 日龄鸡胚
70% 乙醇 胰酶／EDTA 无添加 MEM 培养基 完全 MEM-10 培养基
无菌解剖剪 无菌镊子 100 cm2 无菌培养皿 10 ml 注射器 无菌胰酶消化瓶（带磁力搅拌棒） CO2 培养箱 500 ml 烧杯 纱布 Sorvall 离心机 250 ml 离心管 150 cm2 组织培养瓶

步骤

1. 将 10 只 9 日龄鸡胚有空气部分朝上放置，喷上 70% 乙醇。

2. 用无菌的解剖剪将鸡蛋的顶部打开，剪掉膜上蛋壳，使膜保持完整。用无菌镊子将膜取掉。其他鸡蛋亦重复相同操作。

3. 取出鸡胚，放入无菌的 100 cm² 培养皿。

4. 剪掉每个鸡胚的头和足，将剩余的身体放入无菌的 100 cm² 平皿中，加入 10 ml 无添加剂的 MEM 培养基。通过 10 ml 注射器（5 个鸡胚/注射器）挤压，将鸡胚切碎并打人无菌的胰酶消化瓶中。

5. 加入 100 ml 37℃ 的胰酶/EDTA，并在加湿的 5% CO₂ 培养箱中 37℃ 持续搅拌温育 5 min。

6. 将液体从无菌胰酶消化瓶中倒人杯口带两层纱布的 500 ml 烧杯，将过滤后的液体转移至 250 ml 离心瓶中。

7. 向含有剩余组织的无菌胰酶消化瓶中加入 100 ml 新鲜的胰酶/EDTA，37℃ 温育。

8. 将消化液倒入另一个杯口带两层纱布的 500 ml 烧杯，并将过滤后的液体加入先前的 250 ml 离心瓶中。

9. 在 Sorvall RC-3B 离心机中，4℃，1200 g 离心 10 min。

10. 丢弃上清，加入 10 ml MEM-10 完全培养基，反复抽吸 10～15 次重悬沉淀，并将体积调整至 100 ml。

11. 将悬液转移至 250 ml 离心瓶中，4℃，1200 g 离心 10 min。

12. 用 5 ml MEM-10 完全培养基重悬沉淀，并将体积调整至 30 ml。

13. 将细胞悬液按每瓶 1 ml 加入到 30 个含有 30 ml MEM-10 完全培养基的 150 cm² 组织培养瓶中。

14. 37℃ 培养几天直至细胞长满，然后将培养瓶转移至加湿的 5% CO₂ 培养箱中 31℃ 保存。

CEF 细胞培养液能够在 31℃ 保存 2～3 个星期。原代的 CEF 细胞也能直接用于病毒生长，或将胰酶处理后的 CEF 细胞冻存在液氮中留以后使用。

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