该方案描述了如何从组织中制备随后可用于染色质免疫沉淀（ChIP）的染色质。

       建议每个ChIP/抗体使用30 mg肝组织。但是，对于其他组织，用量可能不同。组织的确切用量取决于蛋白质丰度、抗体亲和力和交联效率。

       每次ChIP 检测前，使用5-15 µg染色质优化方案。开始X-ChIP检测之前，应确定每种组织类型的确切染色质浓度。我们的交联染色质免疫沉淀（X-ChIP） 方案应该在下面详细介绍的染色质制备后使用。使用的所有溶液中均应含有蛋白酶抑制剂，包括 PBS PMSF 10 µl/ml（如，P408676，P301906）、抑肽酶1 µl/ml（如，A105534）和亮肽素1 µl/ml（如，L420424）。

需要的试剂：

        - FA裂解缓冲液

        - 50 mM HEPES-KOH pH7.5（如，H301907）

        - 140 mM 氯化钠

        - 1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）pH8（如，E196386）

        - 1% Triton X-100（如，T434386）

        - 0.1%脱氧胆酸钠（如，S104198）

        - 0.1% SDS（如，S108346）

        - 蛋白酶抑制剂（每次加入新鲜抑制剂）

第1阶段 交联

1、冰冻组织应在冰上解冻。（该过程可能需要数小时，具体取决于组织量）。

        警告：重要的是，冷冻组织样本不能达到高温，以防样本被蛋白酶降解。应始终将样本置于冰上，并快速执行所有步骤，以尽可能减少解冻。应在置于干冰上的皮氏培养皿中切割组织。

2、用两个剃刀片（1-3 mm3之间）将冷冻或新鲜组织切成小块。

3、测定空的15 mL锥形管的重量，将组织移入管中再次称重，计算组织量。

4、在通风柜中制备交联溶液。每克组织使用10 mL PBS（如，T494526）。加入甲醛，至终浓度为1.5%，在室温下旋转试管15分钟。

        警告：由于甲醛有害，此步骤应在通风橱进行。

5、加入甘氨酸，至终浓度为0.125 M，终止交联反应。室温下继续旋转试管5分钟。

6、将组织样本离心5分钟，720 rpm，4℃。

7、吸取培养基，用10 mL冰冷的PBS（如，T494526）清洗。离心5分钟，720 rpm，4℃，弃去清洗缓冲液。

        注意：此阶段可将组织在液氮中冷冻，并储存于-70℃条件下。避免多次冻融。如果立即使用，将组织重悬在每克起始材料10 mL冷PBS中，置于冰上。

第2阶段 组织降解

1、Becton Dickinson（美国BD公司）提供的Medimachine仪器可用于制备单细胞混悬液。每克组织使用2份medicone（50 μm）进行处理。

2、剪开1 mL移液器枪头，使管口变大。

3、将50-100 mg（3-4块）组织重悬在1 mL PBS（如，T494526）中。

4、将此溶液加入medicone中，研磨组织2分钟。

5、插入18 G钝针和1 mL注射器，从medicone收集细胞。

        注意要在冰上从锥形管中收集细胞。

6、重复上述步骤，直至处理完所有组织。

7、用显微镜检查细胞混悬液，确保获得单细胞混悬液。

        注意：如果需要额外研磨，向组织中加入更多PBS（如，T494526），重复第2阶段的步骤2至5，直至所有组织均被研磨成均质混悬液。

8、将细胞离心10分钟，1000 rpm，4℃。测定/估计下一步的细胞团块体积。

9、小心吸取上清液，用FA裂解缓冲液重悬团块（每 1×107个细胞750 μL）。

10、从超声处理步骤开始，请继续执行交联染色质免疫沉淀（X-ChIP）的实验步骤。

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