什么是荧光染料（荧光团）？

从广义上讲，只要能吸收较短波长光并以较长波长再发射的发色体系，统称为荧光团（fluorophore）。其中一大类是小分子荧光染料（fluorescent dyes），此外还包括荧光蛋白和各类纳米荧光探针等。它们可以是：

• 小分子有机化合物（如荧光素、罗丹明等）
• 蛋白质类荧光团（如 GFP、PE、APC 等）
• 无机或有机纳米探针（如量子点、荧光纳米颗粒等）

在生物和医学研究中，荧光团常用于标记蛋白、核酸、细胞或纳米载体，从而实现：

• 荧光显微成像
• 流式细胞术检测
• 体内/体外分子成像
• 细胞、药物或纳米颗粒的追踪等

理解不同类型荧光染料的特点，有助于在实际实验中做出合适的选择。

荧光染料的常见分类方式

从实用角度，我们可以把常见荧光染料大致分为三大类：

1. 小分子有机荧光染料

• 典型代表：荧光素、FITC、罗丹明、花青（Cy 系列）、BODIPY 等

2. 荧光蛋白

• 典型代表：GFP 及其变体、藻红蛋白（PE）、别藻蓝蛋白（APC）等

3. 纳米荧光探针

• 典型代表：半导体量子点、荧光掺杂二氧化硅纳米颗粒、碳点等

下面分别介绍每一类的特点和代表性染料。

小分子有机荧光染料

这类染料分子量小、合成和修饰方便，是目前使用最广泛的一类荧光标记物。

从光物理角度，可以粗略把常见有机染料分成两类：

• 共振型染料：如荧光素、罗丹明、花青，吸收/发射峰较窄，斯托克斯位移较小，光谱对溶剂极性不太敏感。
• 电荷转移（CT）型染料：如香豆素、丹磺酰类，吸收/发射带较宽，斯托克斯位移大，对环境极性更敏感，适合做环境/极性探针。

接下来重点了解几个最常用家族。

1 荧光素家族与 FITC

荧光素 (Fluorescein)

• 在水溶液中，典型的最大吸收波长约 494 nm，发射约 521 nm，表现为亮绿色荧光。
• 水溶性好、在可见光区激发/发射，亮度高，是历史最悠久、应用最广的绿色荧光染料之一。
• 可用于显微成像、流体示踪（如地下水示踪）、标记蛋白和核酸等。

异硫氰酸荧光素 (FITC)

FITC 是荧光素最经典的反应型衍生物之一：

(1) 激发/发射峰约为 495/519 nm。

(2) 含有异硫氰酸酯反应基团，主要与赖氨酸等氨基发生共价连接（在适当条件下也可与巯基等亲核基团反应），因此常用于抗体、蛋白、肽、寡核苷酸等生物分子的标记。

(3) 典型应用：

• 免疫荧光显微
• 流式细胞术标记抗体
• 标记蛋白或DNA片段用于细胞凋亡检测等

优点：价格相对低、试剂和配套资源丰富，易于上手。

不足：光稳定性一般，容易光漂白；在多色流式中溢出较多，近年来常被更优的 Alexa Fluor 488、CF488 等替代。

荧光素家族

2 罗丹明家族

罗丹明（Rhodamine）与荧光素同属呫吨 (xanthene) 骨架，常见如 Rhodamine 6G、Rhodamine B 等：

(1) 具有较高的摩尔吸收系数和量子产率，光稳定性优于许多传统染料，因此常被用作激光染料和荧光探针。

(2) 通过改变取代基（氨基、羧基等），可以对其发射波长、量子产率、寿命进行精细调控。

在生物实验中，罗丹明及其 NHS 酯常用来标记：

(1) 抗体和蛋白

(2) 聚合物纳米颗粒

(3) 细胞和组织切片

常见罗丹明衍生物（如 TRITC）一般在绿光/黄绿光激发下发射橙红色荧光，适合作为绿色荧光（FITC/GFP）之后的第二通道。

罗丹明家族

3 花青 (Cyanine) 染料家族

花青类染料是现代多色成像和流式面板中非常重要的一类：

(1) “Cy” 系列如 Cy3、Cy5、Cy7 等，通常由两个氮原子之间的多亚甲基链构成，碳数越多，发射波长越长（由橙红到近红外）。

(2) 非磺化花青：水溶性较差，常需先溶于DMSO等有机溶剂，再用于标记反应。

(3) 磺化花青（Sulfo-Cy3、Sulfo-Cy5 等）：引入磺酸基团，提高水溶性，更适合在水相中标记蛋白或纳米颗粒。

典型特点：

(1) 波长覆盖范围极广（从可见到近红外），便于进行多通道、多色成像和流式检测；

(2) 亮度高，但部分染料对环境和 pH 较敏感，且光漂白速度和稳定性视具体结构而定。

花青（Cy）染料家族

4 其他常见有机染料家族

在现代实验中，以下家族也非常常用：

(1) BODIPY 系：具有窄而对称的吸收与发射峰、高量子产率和良好光稳定性，适合构建“可精确调色”的荧光探针。

(2) 香豆素/丹磺酰类：典型 CT 染料，斯托克斯位移较大，对极性敏感，常用于环境/离子探针。

有机染料的“骨架”决定了主要颜色和稳定性，不同家族的“气质”不同，选型时既要看波长，也要看是否适合你的实验体系（溶剂、pH、光照条件等）

荧光蛋白：从 GFP 到 PE、APC

荧光蛋白的特点是：可以通过基因工程直接在细胞内表达，无需外源化学标记，是细胞生物学和发育生物学不可或缺的工具。

1. GFP：经典的绿色标记蛋白

(1) GFP（Green Fluorescent Protein）源自水母 Aequorea victoria，本身是一种约 238 aa 的蛋白。

(2) 野生型 GFP 主激发峰在 ~395 nm，次峰在 ~475 nm，发射峰在 ~509 nm；实验中常用的改造版 EGFP 则优化为适合 488 nm 激光线激发。

(3) GFP等荧光蛋白的光谱一般比小分子染料更宽，在多色流式/显微中串色略重，panel 设计时建议把 GFP 视作一个“固定占用”的绿色通道。

应用亮点：

(1) 作为报告基因，用于监测基因表达和调控元件活性

(2) 与目标蛋白融合，用于观察蛋白亚细胞定位和动态

(3) 构建 FRET 探针，监测 Ca²⁺、cAMP 等信号分子

优点：可在活细胞中长期表达，标记稳定；无需额外加染料。

不足：分子量较大，可能影响目标蛋白功能；光稳定性和亮度较高，但仍不及部分高端小分子染料。

2 PE 和 APC：超亮但较易光漂白的藻胆蛋白荧光团

藻红蛋白 (PE, Phycoerythrin)

(1) 来源于红藻/隐真藻的藻胆蛋白复合物，发射红色荧光；

(2) 具有极高的摩尔吸收系数和量子产率，因此亮度非常高，在流式细胞术中非常常用。

别藻蓝蛋白 (APC, Allophycocyanin)

(1) 同属藻胆蛋白家族，最大吸收峰约在 650 nm，发射峰约在 660 nm，适合与 633/640 nm 激光配合使用。

(2) 相比荧光素类染料，其亮度通常高出数倍，非常适合检测低丰度抗原。

共同特点：

(1) 优点：亮度极高、水溶性好、斯托克斯位移大，非常适合用于流式细胞术的多色标记。

(2) 缺点：蛋白结构较大，对温度、pH 等较敏感；光稳定性不如许多小分子染料，长时间照射下容易光漂白。

因此在需要高灵敏度但不长时间曝光的场景（特别是流式）中，它们非常受欢迎。

荧光蛋白相关产品

纳米荧光探针：量子点与荧光纳米颗粒

5.1 量子点（Quantum Dots）

量子点是尺寸通常在 2–10 nm 的半导体纳米晶体（如 CdSe/ZnS），具有典型的量子限域效应：

(1) 粒径越小，发射波长越短（偏蓝）；粒径越大，发射波长越长（偏红）；

(2) 具有宽的激发光谱 + 窄的发射峰，可用单一光源激发多色荧光，非常适合多重标记。

(3) 典型优势：

• 高量子产率（可达 40–90%）
• 亮度远高于多数有机染料
• 光稳定性极佳，不易光漂白

注：“2–10 nm 尺寸”主要指量子点的无机核心尺寸，水溶性配体或聚合物包覆后，水合粒径通常会增大到十几到几十纳米。

缺点和注意事项：

(1) 传统 Cd 系量子点存在潜在重金属毒性，需要良好包覆和严格剂量控制；

(2) “闪烁（blinking）”现象会影响单分子成像的连续性，虽然通过壳层工程可部分缓解。

生物共轭方式：

(1) 配体交换（如引入巯基或羧基配体）

(2) 共价连接（利用表面的羧基、氨基等官能团）

(3) 封装于聚合物或二氧化硅纳米球中，再在外层进行生物功能化

5.2 其他荧光纳米颗粒（碳点、二氧化硅等）

除了量子点，还有多种荧光纳米材料用于成像：

(1) 碳点、石墨烯量子点：通常具有较低的重金属毒性，更好的生物相容性，适合细胞成像和药物递送。

(2) 荧光掺杂二氧化硅纳米颗粒：将有机染料包埋在二氧化硅基体内，一方面提高光稳定性和亮度，另一方面提供可修饰的表面。

(3) 聚合物点（Polymer dots）：基于共轭聚合物或染料聚集体，兼具高亮度和多功能表面。

需要强调的是：

“纳米颗粒并不天然‘无毒’或‘完全惰性’。”

不同材料（如金属、氧化物、碳基）、不同尺寸和表面修饰，其毒性和非特异性吸附行为差异很大，实验前应查阅具体材料的毒理和生物相容性数据。

纳米荧光探针相关化学品

典型应用场景与选型思路

面对实际实验，常见的问题不是“染料有哪些”，而是我在这个实验里应该选哪一类、哪一种？这里给几个高频场景的简单思路。

1 免疫荧光显微（IF）

常见需求：标记组织或细胞切片中的目标蛋白，观察共定位、多色通道。

(1) 典型选择：

• 绿色：FITC / Alexa Fluor 488 / Cy2 / GFP
• 红色：TRITC / Cy3 / Alexa Fluor 555
• 远红/近红外：Cy5 / Alexa Fluor 647 等

(2) 重点考虑：

• 光稳定性（显微镜下曝光时间长） → 优先选择光稳定性好的染料；
• 光谱分离（避免通道串色） → 合理搭配激发/发射波长。

2 流式细胞术（Flow Cytometry）

常见需求：多指标免疫表型分析（CD 分子等），样本量大、信号短暂。

(1) 典型选择：

• 高亮度通道（用于低表达抗原）：PE、APC及其多聚体（PE-Cy7、APC-Cy7 等）；
• 中等亮度通道：FITC、PerCP、各种 Alexa Fluor / CF 系列。

(2) 重点考虑：

• 不同激光线（405/488/561/640 nm）的匹配；
• 染料亮度与靶标表达水平的匹配；
• 溢出和补偿（panel 设计）。
• PE/APC在流式中的典型缺点是串色较大且不太适合固定后显微长时间曝光，如果样品后续还要做显微观察，尽量避免把关键靶标放在PE/APC上。

3 体内/深部组织成像

常见需求：小鼠体内观测肿瘤、药物分布等。

(1) 更偏向选择近红外（NIR）有机染料(如吲哚菁绿)或量子点/纳米探针：穿透力强、组织自发荧光低。

(2) 重点考虑：

• 生物相容性和毒性（尤其是含重金属的量子点）；
• 在血浆和组织环境中的稳定性与非特异性结合。

小结

1. 荧光染料（荧光团）不仅包括小分子有机染料，还包括荧光蛋白和各类纳米探针。

2. 小分子有机染料 —— 结构清晰、修饰灵活，适用范围最广：

• 荧光素/FITC：经典绿色染料，资源丰富，易上手；
• 罗丹明：光稳定性好，适合作为红色通道；
• 花青（Cy 系）：覆盖可见到近红外，是多色成像的主力。

3. 荧光蛋白 —— 适合做活细胞/活体表达标记：

• GFP 用作报告基因与融合蛋白；
• PE、APC 等藻胆蛋白特别适合高灵敏度的流式检测。

4. 纳米荧光探针 —— 亮度高、可多功能化，但需注意材料毒性与长效安全性：

• 量子点提供卓越的光稳定性和可调谐发射；
• 碳点、荧光二氧化硅等是更偏向生物相容性的一类选择。

5. 选择染料时不要只看颜色，还要考虑：

• 实验平台（显微 vs 流式 vs 体内成像）
• 需要的亮度、光稳定性和成像时间
• 样品类型（固定细胞 vs 活细胞 vs 活体）
• 毒性和生物相容性要求

阿拉丁：https://www.aladdin-e.com/