常规的 PCR 扩增需要进行细菌培养、质粒制备等多步操作后才能进行基因扩增，操作繁琐， 耗时较长，同时在反复的操作中 DNA 量损失也较大，产率较低。在 1989 年 Gussow Clackson 建立了菌落 PCR (colony PCR) 法，菌落 PCR 与我们通常的普通 DNA 的 PCR 的不同在于，直 接以单个菌作为模板。是一种可以快速鉴定菌落是否为含目的质粒的阳性菌落，操作简单、快速，在转化鉴定中较常用

原理

菌落 PCR 实验的基本原理是以单个菌落作为模板，用无菌牙 签挑取单个菌落到 TE 缓冲液中，煮沸 10 min, 涡旋振荡后短暂离心，用 1〜2 国裂解液作为 DNA 模板，省去抽提模板 DNA 这一步，通过特异性引物或通用引物对目的基因进行快速扩增, 大大节约了时间和成本。

应用

【菌落 PCR 实验】的常用应用领域如下：1. 挑取重组子克隆常规的碱裂解和煮沸法 (Sambrook, 1989) 均需要经过菌体过夜培养、菌体裂解及乙醇沉淀过程。一般情况下，在挑取的若干克隆中只有少部分为重组子，因此提取质粒过程消耗的时间很多，而利用菌落 PCR 挑取重组子克隆的过程则避开了提取质粒的繁琐过程。陈淑霞等人利用单菌落 PCR 法直接筛选含有绿色荧光蛋白基因 (green fluorescent protein, GFP) 和不耐热肠毒素 B 亚基和耐热肠毒素融合基因 (LTEST) 外源基因的重组克隆，阳性克隆可以扩增出目的条带，和质粒 PCR 扩增进行比较结果一致。证明单菌落 PCR 进行重组菌阳性克隆的鉴定是非常有效的。2. 基因组测序传统的测序前 PCR 扩增是以碱裂解等方法抽提的 DNA 为模板，成功率高但较为繁琐。釆用 菌落 PCR 方法，将样品跳过 DNA 抽提这一步，直接以菌体热解后暴露的 DNA 为模板进行 PCR 扩增和荧光标记，使建库到测序前各步骤的总成本减少了 1/3。唐晔盛等以] 釆用该法成功测定了 釉稻 (Oryg sativa indica) 广陆矮 4 号的 L3173 号 BAC DNA 全长序列。

操作方法

菌落PCR实验

原理

菌落 PCR 实验的基本原理是以单个菌落作为模板，用无菌牙 签挑取单个菌落到 TE 缓冲液中，煮沸 10 min，涡旋振荡后短暂离心，用 1~2 国裂解液作为 DNA 模板，省去抽提模板 DNA 这一步，通过特异性引物或通用引物对目的基因进行快速扩增，大大节约了时间和成本。

材料与仪器

器材：
固体平板培养基上培养出的单菌落、高压灭菌牙签、抗性平板、EP 管、离心机等。
试剂：
10 × PCR 缓冲液（100 mmol/L Tris-HCl, pH8.3, 500 mmol/L KC1；0. 1% 明胶；15 mmol/L MgCl
2
）、目的基因引物、Triton × 100。

步骤

1、用高压灭菌的牙签挑取单个菌落，先在含抗性的平板上画线，做保种用，然后将牙签置于 20 μL Triton × 100 中搅和一下，以便悬浮涂在牙签上的菌，将相应的菌和平板上的画线区做上对应的记号。

2、将装有 20 μL Triton × 100 的 EP 管煮沸 10 min，冷却后 12000 r/min 离心 1 min 去除细胞碎片。

3、按照预期包含的质粒加好反应体系（25 μL）：

4、PCR 扩增条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30 循环；72 ℃ 5 min；4 ℃ 保存。

5、电泳，观察结果，对阳性的结果相对应的主平板上的菌落保种或者进行测序。

注意事项

1、菌落 PCR 时，加入菌液模板的体积不能过大，否则会影响 PCR 体系，导致扩增失败，一般取 1~2 μL 做 25 μL 的 PCR 体系。模板如果太多了，引物就不够用了，显然扩增不出来，这种现 象在以质粒为模板的 PCR 里面很多，提出来的质粒不要忘记稀释。

2、减少扩增循环，25~30 个循环对于菌落 PCR 是比较合适，扩增循环过多，会产生假阳性。

3、假阳性的控制。如果用载体引物来扩增一般可以降低假阳性，或者多用几对不同的引物扩增，以增加真阳性的筛选结果，PCR 结果最好做酶切鉴定。

4、PCR 条件的控制。热启动可以消除引物二聚体，退火温度可以稍低。

如需了解更多产品详情，请前往阿拉丁官网查询。

https://www.aladdin-e.com