脯氨酸及其衍生物广泛存在于小分子药物、拟肽和药用肽中。近年的药物化学研究表明，4-氟脯氨酸、4-三氟甲基脯氨酸、α-取代脯氨酸和双环脯氨酸等结构，可以改变分子的靶点结合、脂溶性、溶解性和代谢稳定性等性质[1]。

         这些作用与脯氨酸独特的主链结构有关。脯氨酸侧链回接到主链氮原子，形成五元吡咯烷环。环的折叠状态与邻近酰胺键的空间取向相互关联，因此，环上一个取代基的改变有可能继续影响邻近主链以及整个分子的三维构象。

         本文围绕这条关系展开，重点回答一个问题：脯氨酸环上的局部结构变化，如何逐级传递并影响完整药物分子的行为？

1. 脯氨酸环为什么能够调控主链构象

1.1 脯氨酸的五元环结构

         以 L-脯氨酸（L-proline，CAS 147-85-3）为例，其侧链与氨基氮相连，形成五元吡咯烷环。与多数蛋白源氨基酸相比，这一环状结构限制了主链可采用的空间取向，同时吡咯烷环自身仍可发生折叠变化。

         在脯氨酸中，C4对应氨基酸命名中的 Cγ，是本文关注的重要修饰位置。4位引入 F、CF₃、OH 或 NH₂ 等取代基后，可以通过立体电子效应和空间效应改变吡咯烷环的折叠偏好，并进一步影响邻近酰胺及主链构象。

在脯氨酸结构中，γ-碳即 C4 原子。按照 Cγ 相对于环主体平面的偏离方向，常用两类构象描述其主要折叠状态：

         ①Cγ-endo：Cγ 向羧酰基所在的一侧偏离；

         ②Cγ-exo：Cγ 向相反一侧偏离。

         未取代脯氨酸对这两种状态的偏好较弱，二者之间可以快速转换。模型研究估计其环折叠转换能垒约为 10–13 kJ·mol⁻¹[2]。

         脯氨酸提供的是一个构象范围已经缩小、但仍可进一步调节的五元环体系。4位取代基正是调节这一体系的重要位置。

脯氨酸4位取代产生结构效应的主要路径

4位取代基及其立体化学

          ↓

立体电子效应 + 空间效应

          ↓

Cγ-endo / Cγ-exo 的相对稳定性改变

          ↓

邻近羰基和主链空间取向改变

          ↓

酰胺顺反平衡及旋转动力学改变

这条路径描述的是局部构象效应。进入完整药物后，还会叠加其他官能团、溶剂化和蛋白结合等因素。

2. 4-氟脯氨酸如何改变环折叠

2.1 C—F 键具有明显的立体电子效应

         4-氟脯氨酸是研究脯氨酸构象调控较充分的一类模型。

         C—F 键具有较强极性。在4-氟脯氨酸中，F—C—C—N 片段受到gauche effect（邻位交叉构象效应）影响，使 C—F 键倾向采用特定的空间排列。实验表明，这种效应能够稳定特定的吡咯烷环折叠状态[2]。

         对于 L-脯氨酸构型，两个常见4-氟异构体表现出不同的构象偏好：

         Kubyshkin 的核磁共振研究显示，这种构象偏好在不同极性的溶剂中仍然存在，支持其主要来源于 C—F 的立体电子效应，而非简单的溶剂诱导偶极作用[2]。

2.2 环折叠会继续影响主链

         Cγ-endo 与 Cγ-exo 的区别并不局限于吡咯烷环本身。

         Shoulders 等利用氟脯氨酸和其他脯氨酸类似物研究主链构象时发现，侧链取代造成的环折叠偏好能够传递到主链二面角，从而改变羰基和相邻主链基团的空间排列[3]。

因此，两个仅在4位立体化学上不同的氟脯氨酸，在完整药物中可能表现出不同的：

         ①主链构象；

         ②取代基朝向；

         ③蛋白口袋匹配程度；

         ④酰胺构象平衡。

3. 4-CF₃脯氨酸与4-氟脯氨酸有什么不同

         CF₃和F都属于含氟取代，但它们控制脯氨酸环构象的方式不同。

3.1 单氟取代主要体现立体电子效应

         在4-氟脯氨酸中，单个氟原子倾向采用类轴向取向，C—F gauche effect 对环折叠具有明显影响[2]。

3.2 CF₃更容易受到空间效应控制

         CF₃基团体积明显大于单个F。模型研究表明，4-CF₃脯氨酸中的 C—CF₃ 键倾向使CF₃采取类赤道向排列，以减小空间拥挤[2]。

         两类取代可以概括如下：

         Kubyshkin 的实验还表明，4-CF₃脯氨酸虽然具有一定环构象偏好，但这种偏好弱于相应的4-氟脯氨酸[2]。

         这一差异对后面的酰胺顺反平衡非常重要。

4. 脯氨酸衍生物如何影响邻近酰胺

脯氨酸邻近酰胺具有两个需要分别考察的性质：

         1. 平衡时 trans 和 cis 各占多少；

         2. trans 和 cis 之间转换得多快。

         前者属于热力学平衡，后者属于动力学过程。

4.1 trans/cis 平衡是什么意思

肽酰-脯氨酸结构中的酰胺键可以形成两种主要旋转异构体：

         · trans：反式酰胺

         · cis：顺式酰胺

可将 trans/cis 平衡常数写成：

         K(trans/cis) = trans旋转异构体的平衡浓度 ÷ cis旋转异构体的平衡浓度

例如：

如果平衡状态下 trans 占80%，cis占20%，则：

         K(trans/cis) = 80 ÷ 20 = 4

         K(trans/cis) 越大，说明平衡状态下 trans 所占比例越高。

4.2 环折叠为什么会影响 trans/cis 比例

         在氟脯氨酸模型中，偏好 Cγ-exo 的异构体通常提高 trans 酰胺的相对比例；偏好 Cγ-endo 的异构体则使 cis 酰胺比例相对增加[2]。

         这一现象来源于环折叠改变了相邻主链基团之间的空间关系。

         文献经常用相邻羰基之间的 n→π* 相互作用解释 Cγ-exo 对特定主链排列的稳定作用。不过，这种稳定作用的物理来源仍包含轨道相互作用和偶极作用等不同解释，因此在药物设计中，更适合将其理解为局部几何变化引起的整体构象能量差异[2]。

4.3 4-CF₃取代对平衡比例的作用相对有限

         4-CF₃脯氨酸表现出一个很有价值的现象。

         在 N-乙酰基氨基酸甲酯模型中，两种4-CF₃脯氨酸的 trans/cis 比值与未取代脯氨酸较为接近。由这些比例得到的能量差变化不超过约 1.1 kJ·mol⁻¹[2]。

说明4-CF₃取代可以对其他分子性质产生明显影响，同时对稳定态 trans/cis 比例产生较小影响。

5. 酰胺旋转动力学为什么重要

5.1 trans/cis 比例与旋转速率描述不同过程

         cis/trans 酰胺异构化的自由能示意图。图中能级及能垒高度为示意，不代表特定化合物的实际数值。 

         图中包含两个不同的信息。

         cis 和 trans 两个低能状态之间的高度差

         决定平衡时两者的比例，即 K(trans/cis)。

         cis 或 trans 到过渡状态峰顶的高度

         对应酰胺旋转的活化自由能，记作 ΔG‡，决定构象转换速度。

         因此，一个修饰可以对 K(trans/cis) 影响较小，同时明显改变 ΔG‡ 和旋转速率。

         cis 和 trans 分别对应两个相对稳定的酰胺旋转异构体。两者之间的相对自由能差决定平衡时的 cis/trans 比例；从各稳定态到旋转过渡状态的活化自由能则决定 cis/trans 相互转化的速率。不同脯氨酸衍生物可以分别影响这两个参数，因此构象比例变化与异构化速率变化需要独立评价。

5.2 脯氨酸酰胺旋转本身是较慢过程

         酰胺 C—N 键具有部分双键性质，绕 C—N 键旋转需要克服较高能垒。

         肽酰-脯氨酸键在水中的典型旋转能垒约为 80–90 kJ·mol⁻¹，cis/trans 相互转换可处于毫赫兹数量级[2]。

         实验中常使用 交换谱核磁共振（exchange spectroscopy nuclear magnetic resonance，EXSY NMR）测量两个旋转异构体之间的交换速率，再利用 Eyring 关系计算旋转活化能垒。

         ΔG‡降低时，酰胺旋转速度会相应增加。由于交换速率与活化能垒呈指数关系，数千焦每摩尔的能量变化即可造成明显的速率差异。

5.3 Cγ-exo可能参与酰胺旋转过渡状态

         Kubyshkin 对4-F、4-CF₃以及其他脯氨酸类似物进行比较后发现，不同4位立体异构体的酰胺旋转速度存在系统性差异。

这些数据支持一个机理模型：

         肽酰-脯氨酸酰胺旋转的主要过渡状态倾向采用 Cγ-exo 环构象。[2]

在该模型中：

         ①容易采用 Cγ-exo 的脯氨酸类似物，进入旋转过渡状态所需的构象调整较小；

         ②不利于形成 Cγ-exo 的类似物，需要付出更多构象能量；

         ③取代基与邻近羰基之间的偶极关系还可能进一步改变过渡状态能量。

         在两种4-CF₃脯氨酸模型中，基态 trans/cis 比例差异较小，但 cis→trans 旋转能垒仍出现约 2.0–2.6 kJ·mol⁻¹的差异[2]。

         这一结果说明，环构象既可以控制稳定构象的比例，也可以控制构象转换过程。

6. 局部构象变化如何影响完整药物分子

         前述研究主要揭示了脯氨酸局部结构与环折叠、酰胺构象及旋转动力学之间的关系。进入完整药物后，这些局部效应还需要通过多个层级才能最终表现为结合和药物性质的变化。

6.1 靶点结合：改变有效结合构象的可及性

         蛋白—配体结合要求药物采用与结合口袋互补的三维构象。

         如果某种脯氨酸取代提高了与结合态相近构象的比例，药物从游离状态进入结合状态时所需的构象调整可能减少。这种现象通常称为构象预组织（conformational preorganization）。

脯氨酸类似物的设计因此需要同时关注：

         ①游离分子的环折叠偏好；

         ②蛋白结合态的环折叠状态；

         ③邻近羰基的方向；

         ④取代基在口袋中的空间位置；

         ⑤是否需要保留一定的局部构象适应能力。

         Shoulders 等的研究证明，脯氨酸侧链的立体电子和空间效应能够传递到主链结构，因此环上取代可以改变主链预组织程度[3]。

6.2 脂溶性：取代基本身与三维偶极排列共同决定结果

         简单的“F增加极性”或“CF₃增加疏水性”不足以描述完整脯氨酸衍生物的物性。

         在 N-乙酰基脯氨酸甲酯模型中，Kubyshkin 测得：

两个4-F非对映异构体之间也出现约0.18个 logP 单位的差异[2]。它们的分子式和官能团组成相同，差别来自取代基方向和整体偶极排列。因此，脂溶性受到多个因素共同影响：

         取代基本征性质 + 环构象 + 键偶极方向 + 分子内偶极排列 + 溶剂化

         这也是为什么脯氨酸类似物进入完整药物后，需要通过实测 logP 或特定 pH 条件下的 logD 评价其物性。

6.3 溶解性：水合能力与固态晶格共同参与

药物从固体进入水相，需要经历两个重要过程：

         1. 克服晶体中的分子间作用力；

         2. 进入水相后得到充分溶剂化。

         溶解性同时受以下因素影响：极性基团暴露程度；分子整体脂溶性；分子间氢键；晶体堆积方式；熔点和晶格稳定性以及不同构象在固态和溶液中的相对稳定性。

         酰胺旋转发生变化后，分子可以采用的构象及晶体排列方式也可能发生改变。这个联系在 ibuzatrelvir 的研究中得到了较系统的实验观察[4]。

6.4 代谢稳定性：取代基电子性质与三维暴露共同影响代谢

         氟化经常用于降低氧化代谢，但F的引入并不会在所有分子中产生相同结果。

脯氨酸修饰可能通过多条途径影响代谢：

         ①改变特定C—H位点的电子性质；

         ②改变分子的脂溶性；

         ③改变潜在代谢位点暴露程度；

         ④改变分子与细胞色素 P450 酶的结合构象。

         因此，评价代谢稳定性需要结合完整分子的肝微粒体、肝细胞和代谢物鉴定结果，不能根据单个取代基直接推断。

7. Ibuzatrelvir：从P2脯氨酸骨架到完整药物性质

         PF-07817883，通用名 ibuzatrelvir，是从 nirmatrelvir 进一步优化得到的第二代严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）主蛋白酶（main protease，Mpro）抑制剂。

         Pfizer 的研究重点之一，是降低 nirmatrelvir 对细胞色素 P450 3A（cytochrome P450 3A，CYP3A）介导氧化代谢的敏感性，同时保持抗病毒活性和口服吸收[4]。PF-07817883 最终表现出优于 nirmatrelvir 的代谢稳定性。

7.1 P2区域发生了怎样的变化

         Nirmatrelvir 的 P2 部位含有一个高度受限的3-氮杂双环[3.1.0]己烷骨架。

         Ibuzatrelvir 的相应位置使用 (2S,4R)-4-CF₃-L-脯氨酸。

         与此同时，P4区域也进行了结构优化。因此，两种分子的整体脂溶性、溶解性、代谢稳定性和药代动力学差异，是多处结构调整共同作用的结果[4]。

         这一点对于分析 P2 脯氨酸的作用尤其重要：P2区域可以用于解释局部构象和口袋匹配，但整分子的所有ADME变化不能全部归因于4-CF₃-Pro。

7.2 4-CF₃-Pro如何参与Mpro结合

         SARS-CoV-2 Mpro 与 ibuzatrelvir 的晶体结构显示，两者形成稳定的酶—抑制剂复合物。Ibuzatrelvir 与 nirmatrelvir 的总体结合构象高度相似[5]。

         P2位的4-CF₃-脯氨酸位于Mpro的S2区域，与该区域形成有利的疏水和空间互补。

         Ibuzatrelvir 的腈基则与催化残基 Cys145 形成可逆共价加合物。结构研究显示，Cys145的巯基进攻腈基后形成硫代亚胺酸酯型加合物[5]。

因此，P2位4-CF₃-Pro具有两类结构作用：

         ①调整P2局部骨架和环构象；

         ②提供与S2区域匹配的疏水体积和空间形状。

7.3 P2/P3酰胺旋转出现明显变化

         PF-07817883 与 nirmatrelvir 的一个重要差别，是 P2/P3 区域酰胺旋转受到的限制程度不同。

         Allerton 等利用核磁共振和固态分析比较两种化合物，发现两者均存在可观察的酰胺旋转异构体，但 PF-07817883 的异构体交换明显更快，旋转能垒也更低[4]。原始研究明确指出，两者的旋转异构体转换速率和能垒存在明显差异。

         论文报告的代表性参数为：

         旋转半衰期由约10.5 min降低至约0.21 min，对应约50倍的时间尺度差异[4]。

         虽然论文报告的旋转能量仅相差约1.5 kcal·mol⁻¹，但酰胺旋转速率对旋转能垒十分敏感，因此仍可产生明显的动力学差异。

这个结果与前面的模型研究形成了对应关系：

         脯氨酸局部骨架变化 → 环构象约束发生变化 → 邻近酰胺旋转能垒变化 → cis/trans旋转异构体交换速度变化

7.4 酰胺动力学为什么可能影响固态和溶解行为

         Allerton 等还研究了两种分子的固态性质，并将酰胺旋转受限程度与晶体结构和溶解行为联系起来讨论[4]。

         酰胺旋转较慢时，某些构象可能在固态中保持较长时间，并参与形成稳定的晶体排列；旋转能垒降低后，分子的构象交换速度增加，晶体堆积方式和晶格稳定性也可能随之变化。

需要强调的是，这种关系涉及多个因素：

         酰胺动力学 + 分子整体结构 + 分子间作用力 + 晶型 共同决定最终固态性质。

7.5 整分子优化的结果

         原始研究报告 PF-07817883 的 logD 约为0.9，而 nirmatrelvir 约为1.9；同时，PF-07817883 在人肝微粒体中表现出更低的内在清除，并具有较好的口服药代特征[4]。

         这些结果反映了一项药物优化中不同层面的协同变化：

         这里能够建立较直接实验联系的是结构、酰胺动力学、蛋白结合方式和完整药物性质均发生了可测量变化。每一项整体ADME结果仍受到整个分子结构共同控制。

8. 如何把这些机理用于药物设计

         脯氨酸类似物的价值，在于它提供了一个可以同时研究局部构象和药物性质的结构变量。

         实际项目可以按照不同问题选择相应实验。

如果一个先导化合物已经含有 Pro，可以根据实际问题设计一组匹配分子对，例如：

         Pro → (2S,4R)-4-F-Pro → (2S,4S)-4-F-Pro → 4,4-diF-Pro → 4-CF₃-Pro

         比较时不宜只观察 IC₅₀。活性、构象、旋转动力学、logD、溶解性和代谢稳定性联合分析，才能判断取代基究竟改变了哪一个分子过程。

         基于上述构象调控机制，在实际研究中可根据取代位置、立体化学和保护形式选择不同脯氨酸衍生物作为合成砌块或构象研究工具。以下列出与上述研究方向相关的代表性化学品。

9. 相关脯氨酸衍生物与研究用化学砌块

表1. 母体脯氨酸与α-甲基脯氨酸

表2. 4-羟基脯氨酸

表3. 含氟脯氨酸

表4. 4-氨基脯氨酸与双环脯氨酸

         注：以上为阿拉丁代表性科研相关产品，具体用途应结合产品规格、批次COA及目标反应或评价体系确定。更多产品规格、级别和COA信息可用“品名/CAS/货号”在阿拉丁官网检索。

参考文献

[1] Kubyshkin V, Mykhailiuk PK. Proline Analogues in Drug Design: Current Trends and Future Prospects. Journal of Medicinal Chemistry. 2024;67(22):20022–20055. doi:10.1021/acs.jmedchem.4c01987.

[2] Kubyshkin V. Polarity Effects in 4-Fluoro- and 4-(Trifluoromethyl)prolines. Beilstein Journal of Organic Chemistry. 2020;16:1837–1852. doi:10.3762/bjoc.16.151.

[3] Shoulders MD, Satyshur KA, Forest KT, Raines RT. Stereoelectronic and Steric Effects in Side Chains Preorganize a Protein Main Chain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2010;107(2):559–564. doi:10.1073/pnas.0909592107.

[4] Allerton CMN, Arcari JT, Aschenbrenner LM, et al. A Second-Generation Oral SARS-CoV-2 Main Protease Inhibitor Clinical Candidate for the Treatment of COVID-19. Journal of Medicinal Chemistry. 2024;67(16):13550–13571. doi:10.1021/acs.jmedchem.3c02469.

[5] Chen P, Van Oers TJ, Arutyunova E, et al. A Structural Comparison of Oral SARS-CoV-2 Drug Candidate Ibuzatrelvir Complexed with the Main Protease (Mpro) of SARS-CoV-2 and MERS-CoV. JACS Au. 2024;4(8):3217–3227. doi:10.1021/jacsau.4c00508.

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