材料与试剂

开始实验前，请准备以下材料：

• CP-466722（C128014，Aladdin Scientific）——于−20 °C干燥避光保存。
• 无水DMSO（细胞培养级），用于配制储存液。
• 适合所用细胞系的完全细胞培养基（例如DMEM + 10% FBS）。
• 若研究ATM激活，需准备DNA损伤剂（如电离辐射源，或依托泊苷、阿霉素等放射模拟物）。
• 针对ATM底物的磷酸化特异性抗体（如p-KAP1 S824、p-Chk2 T68、p-H2AX S139），用于下游检测。
• 标准Western印迹或流式细胞仪设备。
• 微量离心管、生物安全柜及标准细胞培养耗材。

注意：所列浓度均为通用起始参考值，需针对每种细胞系和实验情境进行实验优化。

储存液的配制

按照以下步骤配制CP-466722的DMSO储存液：

1. 计算所需体积：从产品C128014随附的质检证书（CoA）中获取CP-466722的分子量。使用以下公式：体积（µL）= 质量（mg）÷ [分子量（g/mol）× 目标浓度（M）] × 10⁶。
2. 溶解：将计算所得体积的无水DMSO直接加入含CP-466722的小瓶中。轻柔涡旋30–60秒，必要时在水浴中超声5分钟，确保完全溶解。
3. 目标储存浓度：建议在DMSO中配制10–50 mM储存液，以确保培养基中DMSO终浓度≤0.1%（v/v）。
4. 分装与保存：将储存液分装至单次用量的微量离心管中（如每管10–20 µL）。在惰性气体下密封或旋紧管盖后于−20 °C保存。避免反复冻融（冻融次数≤3次）。
5. 质量检查：目视确认溶液清澈均一。使用前发现沉淀的分装液应予丢弃。

审核提示：计算体积前请从产品CoA（C128014）确认准确分子量。

细胞处理方案

本方案概述了贴壁哺乳动物细胞单层中ATM抑制的实验流程，如需处理悬浮培养细胞，请相应调整。

1. 细胞铺板：在处理前16–24小时，将细胞以适当密度接种于完全培养基中，使给药时细胞汇合度达70–80%。
2. 预处理：用新鲜完全培养基替换旧培养基。从DMSO储存液中加入CP-466722，使其达到所需工作浓度（通常为1–10 µM）。在对照孔中加入等体积DMSO作为溶剂对照。轻轻摇动培养板使其混匀。
3. 孵育：在加入CP-466722后，于37 °C、5% CO₂条件下孵育1小时，再进行DNA损伤诱导。此预孵育步骤可使抑制剂在细胞内充分积累。
4. DNA损伤诱导（如适用）：在不去除含CP-466722培养基的情况下，按照已建立的损伤方案，对细胞施加选定的DNA损伤剂（如辐射或放射模拟物）。
5. 损伤后孵育：在CP-466722存在条件下继续孵育，按所需时间点收样（如损伤后0.5、1、2、4小时）。
6. 收样：在每个时间点吸去培养基，用冰冷PBS洗涤细胞，然后根据下游实验需求进行裂解（如Western印迹使用RIPA裂解液，流式细胞术则进行固定/透化处理）。
7. 对照组：务必设置以下对照：(a) 未处理细胞，(b) DMSO溶剂对照，(c) 仅DNA损伤（无抑制剂），(d) 仅CP-466722（无DNA损伤）。

下游检测与数据解读

可通过以下终点指标确认CP-466722对ATM的有效抑制：

• Western印迹：检测ATM典型底物的磷酸化水平，如KAP1（pS824）、Chk2（pT68）和p53（pS15）。ATM抑制成功后，与DMSO对照相比，DNA损伤后上述底物磷酸化水平降低。
• 免疫荧光：定量检测γ-H2AX（S139）焦点作为DNA双链断裂标志物。CP-466722处理不直接抑制H2AX磷酸化，但根据下游信号通路背景，可能影响焦点消解动力学。
• 流式细胞术：分析细胞周期分布，评估检查点阻断情况。ATM抑制可能导致DNA损伤后G1/S或G2/M检查点应答减弱。
• 可逆性验证：为确认可逆性，用不含抑制剂的新鲜培养基更换三次以洗去CP-466722，再用DNA损伤剂重新刺激，监测ATM底物磷酸化的恢复情况。

注意：需在每个实验体系中通过细胞活力实验（如MTT法或台盼蓝排除法）确认工作浓度下不产生细胞毒性。

故障排除