神经干细胞的特点是能够自我更新和生成中枢神经系统中的不同细胞类型，包括神经和胶质亚型。神经祖细胞群的分离和体外分析对于破译神经发生的细胞和分子机制，以及优化基于干细胞的神经系统疾病和损伤的治疗都很重要。在成年哺乳动物的大脑中，NSCs主要存在于两个神经源区：海马的齿状回（DG）的颗粒下区和侧脑室的脑室下区（SVZ）。最近，利用多能干细胞制造患者衍生的神经祖细胞，有助于生成许多与年龄相关的神经系统疾病的Disease-in-a-Dish”模型。

图1. 哺乳动物大脑中的神经发生区域：在成年和发育中的哺乳动物大脑的海马齿状回和室管膜下区（SVZ）发现增殖的神经干细胞。

方法

神经组织中神经干细胞的分离

1. 实验室的小鼠或大鼠通过腹腔注射230mg/kg戊巴比妥钠或400mg/kg三溴乙醇进行麻醉，然后进行安乐死。

2. 解剖取出大脑并转移到50mL试管中，放入10cm的培养皿（C7071）中，培养皿中含有20 mL冷溶液A（1×HBSS（H377731），含有30mM葡萄糖（G116304）、2mM Hepes（H109408）、26 mM NaHCO3（S112331））。将一小块滤纸放在组织切碎器上，用湿无菌棉签稍微湿润滤纸，然后用弯尖钳子将大脑放在湿滤纸上。将大脑切成400μM的冠状切片，并使用湿无菌拭子将含有SVZ（约6个切片）和海马（约5个切片）的切片收集到一个装满5mL溶液A的6cm培养皿（B5222）中。

关键步骤：在切割和解剖过程中，将含有脑切片和溶液A的培养皿放在冰上。

3.在解剖显微镜下解剖出SVZ和DG（脑图），并将解剖后的组织分别保存在15mL的离心管（C1506）中，每个管中含有10mL的冷溶液A。

关键步骤：本步骤和后续步骤是为从一只小鼠的SVZ和DG制备中分离NSC而优化的。如果您打算从一只以上小鼠的集合组织中分离细胞，我们建议您增加Percoll（P331004）纯化的步骤，以去除多余的髓鞘和其他细胞类型。

4.完成所有脑部切片的解剖后，在室温（20-25℃）下，用低速离心机以200g旋转1分钟，将组织块旋转下来。

5.在层流罩中除去上清液，在每个含有组织块的15mL锥形管中加入1mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA（T301862）。在室温下将锥形管旋转10-20分钟。

注意事项：孵化时间不要超过30分钟，因为这将降低细胞的活力。

6.在每个试管中加入1mL的胰蛋白酶抑制剂溶液（T113170），再旋转10-20分钟。

注意事项：孵化时间不要超过30分钟，因为这将降低细胞的活力。

7.预先润湿火磨玻璃吸管，通过上下移液10-20次，使组织三聚氰胺（M108433）化，直到没有组织结块，然后在每个试管中加入8mL的N2培养基，N2补充剂，L-谷氨酰胺（G105425）。在室温下以200g的速度将细胞颗粒化5分钟。

注意事项：避免在滴定组织时产生气泡，因为这将降低细胞的活力。

关键步骤：将SVZ和DG解离成单细胞是很重要的，因为任何剩余的聚集物都会导致产量减少。

8. 用10 mL N2培养基洗涤细胞两次，每次在室温下以200 g旋转5分钟。

9. 如果您从2只或更多小鼠的集合组织中分离细胞，用5.5 mL N2培养基重新悬浮每个细胞颗粒，加入5.5 mL Percoll/PBS溶液，并通过倒置试管进行混合。在室温下，以400g的速度将细胞沉淀15分钟。然后用10 mL N2培养基洗涤细胞3次，每次在室温下以200 g旋转5分钟，收集细胞。

关键步骤：轻轻地除去上清液，因为细胞颗粒可能没有牢固地附着在管子的底部。关键步骤：通过彻底清洗去除Percoll是很关键的，因为残留的Percoll会影响细胞的活力。

10. 再用8 mL初始增殖培养基（IPM）（神经干细胞基础培养基、L-谷氨酰胺、1×Pen-Strep、20 ng/mL FGF-2和20 ng/mL EGF洗一次）。

11. 用1 mL IPM（DG）、2 mL IPM（SVZ）重新悬浮每个细胞颗粒，然后将细胞装入24孔组织培养板的一个孔中，用于DG，2个孔用于SVZ细胞。将细胞在二氧化碳培养箱中培养48小时。

12. 更换一半的IPM，避免去除任何细胞。继续培养细胞7-14天，每隔一天更换一半的IPM并监测细胞的神经球的形成。神经球应在1-2周内在两种培养物中形成。

人iPSCs向NSCs的分化

双重SMAD抑制是一种成熟的方法，可以从单层培养的人类ES/iPS细胞中获得神经祖细胞。该方案使用两种SMAD抑制剂，Noggin和SB 431542，以驱动ES/iPS细胞快速分化为高度富集的NPCs群体。Noggin作为一种BMP抑制剂，SB431542通过阻断ALK4、ALK5和ALK7受体的磷酸化来抑制Lefty/Activin/TGFβ途径。为了使神经元分化方案更加明确和优化，研究人员修改了原来的方案，建立了一个完全基于小分子的分化方法，它依靠三种小分子来抑制GSK-3β、CHIR99021（C125082）、TGFβ、SB431542和Notch、Compound E（C275008）信号通路，以及人LIF。这种新的基于小分子的神经分化方案提高了神经分化的动力学，并允许衍生出真正的多能神经干细胞，对指定前脑、中脑和后脑神经和胶质亚型的区域模式线索作出反应。

神经干细胞的特征

目前，神经干细胞的识别通常是基于与干细胞和/或祖细胞状态相关的分子标记的存在，以及缺乏通过标记分析评估的更多分化表型。NSCs正向表达干细胞标志物Nestin、Sox-2和Musashi，而缺乏更多的分化系标志物，包括神经元的βIII-管蛋白，星形细胞的GFAP和少突胶质细胞的O1。

表1.神经干细胞标志物

神经干细胞的扩增

在三维神经球体中培养NSCs

13. 神经球体经过培养7-12天后（上述步骤1-12），在不干扰附着细胞的情况下收集所有原生球体，在室温下以200g旋转5分钟。

14. 小心地除去培养基，向每个管子中加入1mL 0.05%的胰蛋白酶/EDTA（T301862）。用1mL的蓝色吸头上下吸20次，在2分钟内消化球体，使球体解离。在每个试管中加入1mL胰蛋白酶抑制剂溶液（T113170），再向上和向下移液10次。在每支试管中加入5mL IPM，倒置试管数次进行混合，并在室温下以200g的速度将细胞沉淀5分钟。

15. 将DG细胞颗粒重新悬浮于1mL IPM中，将SVZ细胞颗粒悬浮于2mL N2培养基中。将每个样品的10μL等分试样稀释在10μL 0.5%的台酚蓝（T293438）中，用血球计数仪计算存活细胞。

16. 将DG细胞装入24孔板的一个孔中，将SVZ细胞装入6孔板的一个孔中，孵化细胞。

17. 每隔一天为DG细胞更换一半IPM培养基，为SVZ细胞更换新鲜的N2培养基，持续1周。在更换一半的培养基时，避免取出任何细胞。第一期后，在N2培养基中维持DG和SVZ的造血干细胞，每隔2-3天以3×104-1×105个细胞/mL的速度播种造血干细胞。

二维单层培养中的NSCs的培养

为了使NSCs能够更好的生长和粘附，我们建议在组织培养塑料或玻璃器皿上涂抹聚-L-鸟氨酸和层粘连蛋白。

18. 用水稀释聚-L-鸟氨酸的库存浓度（0.1 mg/mL），得到：a. 20 μg/mL用于聚苯乙烯板b. 50 μg/mL用于玻璃板。

19. 加入足够的聚-L-鸟氨酸溶液以覆盖整个组织培养器皿的表面。3.5cm板用2mL体积，6cm板用5mL体积，10cm板和T75烧瓶用10mL体积。在加湿的37℃培养箱中培养至少一小时。

20. 取出聚-L-鸟氨酸溶液，用无菌水冲洗一次，冲洗后吸出。

21. 对于NSCs的培养、繁殖和分化，将层粘连蛋白稀释到最终浓度为5μg/ml。涂层板和烧瓶可在2-8°C的层粘连蛋白溶液中储存3周，或在-20°C储存6-8个月。在使用前，将涂层板或烧瓶升至室温，并吸出层粘连蛋白溶液，使用前用1× PBS（P301982）冲洗平板一次。

22. 从液氮中取出小瓶的神经祖细胞，在37℃水浴中孵化，密切监测，直到细胞完全解冻。

重要提示：不要涡旋细胞。

23. 细胞完全解冻后，立即用70%的乙醇对小瓶外部进行消毒。在层流罩中，用1或2mL吸管将细胞转移到15mL无菌锥形管中。在转移过程中要注意不要引入任何气泡。

24. 使用10mL吸管，缓慢地将9mL神经扩展培养基（预热至37℃）滴加到15mL锥形管中。

重要提示：不要一次性将整个体积的培养基加入到细胞中，这可能导致因渗透性休克而导致的细胞活力下降。

25.通过缓慢地向上和向下移液两次，轻轻地混合细胞悬液，操作过程中不要引入任何气泡。

重要提示：不要对细胞进行涡旋。

26.在室温下以200g离心3-5分钟，使细胞颗粒化。

27.尽可能多地倾倒上清液。

28.将细胞重悬于总体积为2mL的含有FGF-2，20ng/mL的神经扩展培养基（预热至37℃）。

29.将细胞混合物装入涂有聚-L-鸟氨酸和层析蛋白的3.5cm组织培养板。

重要提示：为了能够最佳生长，不建议在大于3.5cm的组织培养板上解冻细胞。

30. 将细胞在37℃的5%二氧化碳加湿培养箱中培养。

31. 第二天，用含有FGF-2（20 ng/mL）的新鲜神经扩展培养基（预热至37℃）交换培养基，此后每隔一天用新鲜培养基进行交换。

32. 当细胞大约90-100%汇合时，它们可以用Accutase™进行分离，并进行传代或冷冻以备后用。细胞应始终保持较高的细胞密度，因此建议以1:2至1:6的比例传代。

图2. 神经干细胞的培养特点：NSCs可作为浮动的三维神经球（A）或附着的二维单层（B）在聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白涂层板上生长，多能的神经干细胞表达Nestin（C）和Sox-2（D）。

常见问题

1.NSCs多久加倍一次？多久分裂一次培养物？

人类造血干细胞每48-72小时翻倍一次，鼠类NSCs每24小时翻倍一次。细胞应在80%汇合后按1:2至1:6的比例进行分离，大约每3-5天一次。

2.细胞生长速度低于正常值可能是什么原因造成的，如何解决？

每天更换培养基以确保快速增殖，使用新鲜的培养基和新鲜补充的bFGF。等到细胞80-90%汇合后，再按1:2至1:4的比例进行分离，检查以确保细胞没有分化。

3.如果细胞不能粘附在P/L涂层板上，应该怎样做才能建立单层的NSC培养？

涂有Poly-L-Ornithine/Laminin的平板有问题，用新鲜的Poly-L-Ornithine/Laminin溶液重新涂抹新的平板。

4.在培养物中发现大量的细胞死亡/浮动细胞，这是否正常？

这是一种松散的贴壁细胞培养，细胞和细胞碎片漂浮在培养基中是很常见的。只要平板上的粘附细胞在单层中生长良好，就不必担心漂浮的细胞，它们会在更换培养基时被洗掉。

5.如何将细胞分化成特定的神经表型？

所提供的分化方案/培养基是作为一个基础的系统。对于特定的细胞类型，可以根据最终用户的兴趣来制定包括额外神经营养因子的分化方案。

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