在对DNA片段的修饰中，脱磷酸化反应是一个重要内容,该反应有碱性磷酸化酶催化，该酶可使线状DNA上去除5'磷酸基团。

操作方法

基本方案

材料与仪器

DNA片段
碱性磷酸酶 酚 氯仿 EDTA SDS TE缓冲液 电泳缓冲液 NH4AC
离心机 恒温设备 真空干燥机 取液器

步骤

1.  在实验四所得DNA限制性内切酶片段中加入
（1）10×碱性磷酸酶缓冲液  10 μl
（2）碱性磷酸酶（0.01 u/pmol ends）  1-2 ul
（3）ddH₂O到100 ul
（4）对于5‘突出则37℃下温浴30分钟，再加入1 ul CIAP（0.01 u/pmol ends），37℃下温浴30分钟。
（5）对于平末端或3’突出末端，则37℃下温浴15分钟，56℃下温浴15分钟，再加入1 ul CIAP（0.01 u/pmol ends），37℃下温浴15分钟。56℃下温浴15分钟。
2.  温浴结束后加入EDTA（pH8.0）至终浓度分别为10 mM，65℃加热20 min，以灭活碱性磷酸酶。
3.  用酚、氯仿各抽提一次。
4.  加入1/2体积NH₄AC，充分混匀，再加入2体积的乙醇，-20℃放置2 hr（或-70℃30分钟），12 000 g 离心10分钟，沉淀DNA。
5.  冷70%乙醇洗沉淀一次。
6.  TE溶解（终浓度为100 μg/μl），-20℃保存。

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