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实验方案（Protocols）

T细胞杀伤功能的检测

· · 发布于 · 更新于 ·
简介

T细胞杀伤功能的检测可以应用于（1）免疫细胞功能测定（2）临床免疫诊断。

操作方法

T细胞杀伤功能的检测

步骤

基 本 方案 1 抗 CD3 诱 导 的 T 细胞杀伤实验 材 料 靶细胞： E B 病 毒 （E B V ) 转 化 的 B 淋 巴 母 细 胞 （A T C C : # 1 6 1 2 ; 单 元 8. 16) n/ R P M I -5完全培养基 lmCi/ml Na2 [51Cr] O 4 (51 Cr^ 3 0 0 mCi/mg； Amersham) ' T 细 胞 （效 应 性 细 胞 ）：单 个 核 细 胞 、 T 细 胞 或 T 细 胞 亚 群 （单 元 8 . 3 或单元 7. 2)，来自正常非免疫个体 抗 CD3 抗 体 （IgG2a) ，由 OKT3 腹 水 或 培 养 上 清 纯 化 （单 元 1 . 5 ) 或 商 品 化 试 剂 (Ortho Diagnostic 或 Becton Dickinson) 2 % (V /V ) Triton X-100 2 4 孔平底细胞培养板（Costar) Sorvall离心机及 HlOOOB转 子 （或替代品） 9 6 孔圆底细胞培养板 （Costar) 1 . 在 2 4 孔 板 各 孔 中 加 入 5 X IO5E B V 转 化 的 B 细 胞 ，补 充 RPMI- 5 完全培养基至 I .9ml。 再加入 0•Iml 51Cr (IOOjuCi) ， 37°C标记 18〜24h。 2 . 收集标记后的B 细胞并加入离心管中。加 入 IOml R P M I -5完全培养基，室温， 250g 离 心 5min，洗涤细胞。台盼蓝拒染法计数活细胞（附 录 3 0 。用 R P M I -5完全培养 基 ，调整浓度至5X 103个细胞/50/^1 (即 I X l O 5个细胞/ml)。 3•从IX lO 5个细胞/IOOmI 开始，用 R P M I -5完全培养基，将 效 应 性 T 细胞进行至少 4 个浓度的系列稀释，起始效应细胞：靶 细 胞 （effector : target， E : T ) 为 20 : 1。 4•从4Mg/m l 开始，用 R P M I -5完全培养基，将 抗 C D 3 抗体进行至少5 个浓度的4 倍系 列稀释。 5 . 在 9 6 孔板各孔中，加 入 50^1放射标记的靶细胞、 50^1不同稀释度的抗C D 3 抗体和 I O O W 不同稀释度的效应细胞，各 组 设 3 复孔。自发释放对照组只加入靶细胞（不加 抗体及效应细胞）。使用单个核细胞进行实验时，应设置含靶细胞和效应细胞的对照 组 （不加抗体），即 N K 细胞杀伤活性对照组。在 另 一 块 9 6 孔板中，设置最大释放 对照组，其 中 加 入 5 \ 1 0 3标 记 后 靶 细 胞 和 150/^12%1^1〇111-100，也 设 3 复 孔
250g 离 心 2m i n 后 ，将培养板置培养箱孵育4h 。 6•将培养板200g 离 心 5min。用移液器从各孔中吸取100M1上 清 ，或用自动收集仪收集 细胞培养上清。然 后 用 7 液闪仪检测上清的cpm值 。结果计算如下： .100X (实验组一自发释放） 特异杀伤率 最大释放一自发释放 其中，自发释放为自发释放对照组的cpm值 ；实验组为待测孔c p m 值 ；最大释 放 为 含 Triton孔 的 cpm值 。确保自发释放cpm值< 2 5 % 最大释放值。使用单个核细 胞实验时，实 验 组 cpm值应减去无抗体组的cpm值以消除N K 细胞的影响。 基 本 方 案 2 抗原诱导的特异性T 细胞杀伤功能的检测 附 加 材 料 （其他材料见基本方案 1) 合成的病 毒 抗 原 肽 （推荐使用） M E M 非 必 需 氨 基 酸 （JRHBioscience) 含流感病毒的鸡胚尿囊液（H A 滴 度 1 : 128或以上），无 支 原 体 污 染 （如 A /H K /; A T C C # V R 544 或 A /J A P /305; A T C C # V R 100) 含 5 % (V7 V ) FBS 的 PBS (附录 1) 流感病毒免疫后志愿者特异性T 细胞，间 隔 采 血 （单 元 8. 2 和 8. 3) 6m l细胞培 养 管 （Falcon) 1• 将 靶 细 胞 （E B V 转 化 的 B 细胞）用51C r 标 记 （见 基 本 方 案 1 ，步 骤 1)。或者 ，用合 成的病毒抗原肽冲击E B V 转 化 的 B 细胞 。方法如下：在 转 化 的 B 细 胞 中 加 入 1〜 10/xg合成肽，然后加入51C r , 标 记 18〜24h 后直接进入步骤4 。 2•将标记后的靶细胞加入6m l 细 胞 培 养 管 中 （I X l O 6〜 3 X 106个细胞/管）。室 温 ， 2 5 0 心 离 心 5min，弃上清。加 入 0.5m l 含 I X M E M 非 必 需 氨 基 酸 的 R P M I -5完全 培养基重悬细胞，再 加 入 0.1m l 病毒感染尿囊液。同时设置未感染尿囊液的阴性对 照组。培养管置37°C 水 浴 30min。 3•加入10m l 5 % F B S 。室温， 250g 离 心 5min，弃上清。用 5m l R P M I -5重悬细胞。培 养 管 置 37°C 水 浴 5h 。 4•加入5m l 5 % F B S 。室温 ， 250g 离 心 5min，弃上清。用 l m l R P M I -5重悬细胞。台 盼蓝拒染法计数活细胞（附 录 3 0 , 用 R P M I -5完全培养基调整细胞浓度至5 X IO3 个细胞/0. lml。 5•将效应性T 细 胞 稀 释 后 （见基本方案1 ，步 骤 3)，进行杀伤功能检测。实验组和各 对照组设置、上清收集及检测同前（见基本方案1 ，步 骤 5 和 6)。
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常见问题

本实验来自「精编免疫学实验指南」作者：J.E.科利根等,译者：曹雪涛等


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目录： 实验方案（Protocols）
探索主题： 免疫学实验

Da — 若无特别说明，分子量单位默认为道尔顿。   Mw — 重均分子量。   Mn — 数均分子量。

产品仅供科研与开发使用，不用于人体、动物、诊断或治疗。

引用本文

阿拉丁科学.《T细胞杀伤功能的检测》. 阿拉丁知识库，更新于 2024年12月23日。 https://www.aladdin-e.com/zh_cn/faqs/detection-of-t-cell-killing-function.html
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