抗坏血酸即维生素 C, 广泛存在于新鲜水果、蔬菜中，它是一种高活性物质，参与 很多新陈代谢活动。抗坏血酸是生物体内抗氧化体系成员之一，因此抗坏血酸含量可作为植 物抗衰老和抗逆境的重要生理指标，也可作为果品质量、选育良种的鉴别指标。通过本实验 掌握用分光光度计法测定植物抗坏血酸含量的方法。

原理

抗坏血酸含量的测定的基本原理是还原型抗坏血酸 (AsA) 可以把铁离子还原成亚铁离子，亚铁离子与红菲咯噂 (BP) 反应形成红色螯合物。此物质在 534 nm 波长的吸收值与 AsA 含量呈正相关，故可用比色法测定。脱氧抗坏血酸 (DAsA) 可由二硫苏糖醇 (DTT) 还原成 AsA。测定 AsA 总量，从 中减去还原型 AsA, 即为 DAsA 含量。

操作方法

抗坏血酸含量的测定

原理

还原型抗坏血酸（AsA）可以把铁离子还原成亚铁离子，亚铁离子与红菲咯啉（4,7-二苯基-1,10-菲咯啉，BP）反应形成红色螯合物。在534nm 波长的吸收值与AsA含量正相关，故可用比色法测定。脱氧抗坏血酸（DAsA）可由二硫苏糖醇（DTT）还原成AsA。测定AsA总量，从中减去还原型 AsA，即为DAsA含量。

材料与仪器

植物材料
三氯乙酸 TCA 无水乙醇溶液 磷酸－乙醇溶液 BP－乙醇溶液 FeCl3－乙醇溶液 DTT Na2HPO4－NaOH溶液 DTT－乙醇
分光光度计 离心机 研钵 试管

步骤

1. 制作标准曲线配制浓度为2mg/L，4mg/L，6mg/L，8mg/L，10mg/L，12mg/L，14mg/L的AsA系列标准液。取各浓度标准液1.0ml于试管中，加入1.0ml 5%TCA、1.0ml乙醇摇匀，再依次加入0.5ml 0.4%H3PO4－乙醇、1.0ml 0.5%BP－乙醇、0.5ml 0.03%FeCl3－乙醇，总体积5.0ml。将溶液置于30℃下反应90min，然后测定A534。以AsA浓度为横坐标，以A534为纵坐标绘制标准曲线，求出线性方程。

2. 提取取植物叶片1.0g，按1∶5（W/V）加入5%TCA研磨，4000r/min离心10min，上清液供测定。

3. 测定

（1）AsA测定取1.0ml样品提取液于试管中，按上述相同的方法进行测定，并根据标准曲线计算AsA含量。

（2）DAsA测定向1.0ml样品液中加入0.5ml 60mmol/L DTT－乙醇溶液，用Na2HPO4－NaOH混合液，将溶液PH调至7~8，置于室温下10min，使DAsA还原。然后加入0.5ml 20%TCA，把PH调至1~2。按AsA相同方法进行测定，计算出总AsA含量，从中减去AsA，即得DAsA含量。

注意事项

反应应具有较高的选择性，即选用的显色剂最好只与待测组分反应，而不与其他干扰组分反应或其他组分的干扰很小。

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