甜菜碱是一种分布很广的细胞相容性物质，许多植物在盐渍、干旱胁迫下，细胞 内大量积累甜菜碱，因此甜菜碱可作为植物抗逆性的一项生化指标。利用化学比色法可测定 植物体内的甜菜碱含量。本实验目的是掌握用化学比色法测定植物体内的甜菜碱的原理和 方法。

原理

植物体内甜菜碱含量的测定的基本原理是碘可与四价铉类化合物 (QACs) 反应，形成水不溶性的高碘酸盐类物质，该物质 可溶于二氯乙烷，并在 365 nm 波长下具有最大的吸收值。根据甜菜碱类化合物与胆碱被碘 沉淀所需的 pH 范围不同，甘氨酸甜菜碱含量等于四价镂化合物的量减去胆碱的量。

操作方法

植物体内甜菜碱含量的测定

原理

植物体内甜菜碱含量的测定的基本原理是碘可与四价铉类化合物 (QACs) 反应，形成水不溶性的高碘酸盐类物质，该物质 可溶于二氯乙烷，并在 365 nm 波长下具有最大的吸收值。根据甜菜碱类化合物与胆碱被碘 沉淀所需的 pH 范围不同，甘氨酸甜菜碱含量等于四价镂化合物的量减去胆碱的量。

材料与仪器

材料: 新鲜菠菜叶片或其他植物叶片。
器材：紫外分光光度计，离心机,Dowex 1 柱或 Dowex 1 与 Aberlite (1 + 2) 混合柱， Dowex 50 柱。
试剂：
①甲醇
②氯仿
③碘
④碘化钾
⑤盐酸
⑥二氯乙烷
⑦KH
2
PO
4
⑧NaOH
⑨甜菜碱提取液以甲醇： 氯仿: 水=12 ： 5 ： 3 的比例配制。

步骤

植物体内甜菜碱含量的测定的基本过程可分为如下几步： 1. 甜菜碱提取和纯化：称取 1〜2 g 菠菜叶片加入 10 mL 甜菜碱提取液研磨。匀浆液在 60〜70P 水浴中保温 10 min。冷却后，于 20 °C 下 1 000 g 离心 10 min, 收集水相。氯仿相再 加 10 mL 提取液，反复振荡, 于 20 °C 下 1 000 g 离心 10 min 取上层水相。下层氯仿相加入4 mL 50% 甲醇水溶液，进行提取，于 20 °C 下 1 000 g 离心 10 min。将上层水相合并，调 pH 5. 0-7.0, 在 70 °C下蒸干，用 2 mL 水重新溶解。 2. 离子交换法纯化：将样品加入 Dowex 1 柱 (1 cmX5 cm,OH ) 或 Dowex 1 与 Amberlite (1 + 2) 混合柱中，用 5 倍柱体积的水洗柱, 收集流出液。流出液直接加入 Dowex 50(1 cmX5 cm,FT) 柱中，用 5 倍柱体积的水洗脱柱子。甜菜碱类化合物由 4 mol - L'1 氨水洗脱而 得，收集 pH 中性的流出液，于 50〜60 °C 下蒸发除去水分，再用适当体积的水溶解。 3. 测定： (1) 标准曲线制作：在 10〜400 • mL'1 范围内分别制作甜菜碱和胆碱标准曲线。 甜菜碱的标准曲线：配制 QACs 沉淀溶液时取 15.7 g 碘与 20 g KI 溶于 100 mL 1 mol - L~undefined HCl 溶液中，过滤，于 4 °C 下保存待用。每个浓度的标准溶液 0. 5 mL 加入 0.2 mL QACs 沉淀溶液混匀，0 °C 下保温 90 min, 间歇振荡。加入 2 mL 预冷水, 迅速加入 20 mL 经 10°C 预 冷的二氯乙烷，在 4 笆下剧烈振荡 5 min,4°C 下静置至两相完全分开。恢复至室温，取下相测 其在波长 365 nm 处吸光度值。胆碱的标准曲线：同上，但反应试剂用胆碱沉淀溶液取代即可。配制胆碱沉淀溶液时，取 15. 7 g 碘与 20 g KI 溶于 100 mL 0. 4 mol • L_1 KH₂PO₄-NaOH 缓冲液 (pH 8. 0) 中过滤，滤 液于 4°C 下保存待用。 (2) 样品测定: 按标准曲线制作方法分别测岀四价铉化合物与胆碱的量。 (3) 实验结果：甘氨酸甜菜碱含量为四价铉化合物的量与胆碱的量之差。

注意事项

被测植株若预先进行渗透胁迫处理，结果会更显著。

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