掌握比色法测定过氧化物酶活性的原理及方法。

原理

过氧化物酶(POD)催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醍类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。本实验以邻甲氧基苯酚(即愈创木酚)为过氧化物酶的底物，在此酶存在下，H₂O₂将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚，该物质可用分光光度计在470 nm处测定其吸光值，即可求出该酶的活性。其反应为：

操作方法

过氧化氢酶（POD）活性的测定

原理

过氧化物酶(POD)催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醍类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。本实验以邻甲氧基苯酚(即愈创木酚)为过氧化物酶的底物，在此酶存在下，H2O2将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚，该物质可用分光光度计在470 nm处测定其吸光值，即可求出该酶的活性。其反应为：

材料与仪器

材料:水稻根系、马铃薯块茎等。
试剂：
（1）0.1 mol · L
-1
Tris-HCl 缓冲液(pH 8.5)：取 12.114 g 三羟甲基氨基甲烷(Tris),加 水稀释，用 HCl 调pH 8.5后定容1000 mL。
（2）2 mol · L
-1
磷酸缓冲液(pH 6. 0):
贮备液 A：0.2 mol · L
-1
NaH
2
PO
4
溶液(27.8 g NaH
2
PO
4
· H
2
O 配成 1000 mL)。
贮备液 B：0.2 mol · L
-1
Na
2
HPO
4
溶液(53. 65 g Na
2
HPO
4
· 7H
2
O 或 71.7 g Na
2
HPO
4
· 12H
2
O 配成 1000 mL )
o
分别取贮备液A 87.7 mL与贮备液B 12.3 mL充分混匀并稀释至200 mL。
反应混合液：取 2 mol・L
-1
磷酸缓冲液(pH 6.0) 50 mL、过氧化氢0.028 mL、愈创木酚0.019 mL混合。
3.器材：分光光度计，移液管，离心机，秒表，研钵，天平等。

步骤

过氧化氢酶（CAT）活性的测定的基本过程可分为如下几步：

1. 酶液提取：取不同水稻根系（根系表面水分吸干）1 g，剪碎置于研钵中，加5 mL 0.1 mol · L^-1 Tris-HCl缓冲液（pH 8.5）,研磨成匀浆，以4000 r・min^-1离心5 min,倾出上清液，必要时残渣再用5 mL缓冲液提取一次，合并两次上清液，保存在冰箱（或冷处）备用。

2. 取光径1 cm比色杯2个在其中1个中加入反应混合液3 mL和磷酸缓冲液1 mL（或加热煮沸5 min的酶液），作为校零对照，另1个中加入反应混合液3 mL,上述酶液1 mL（如酶活性过高可稀释之），立即开启秒表记录时间，用分光光度计在波长470 nmT测量吸光度值， 每隔1 min（60 s）读数1次共测3 min。

3. 结果计算：以每分钟光密度变化（以每分钟人以A₄₇₀为 0.01个活力单位）表示酶活性大小，即

式中：A₄₇₀—反应时间内吸光度的变化；

Vt一粗酶提取液总体积，mL；

V₁一测定用粗酶液体积，mL；

FW—样品鲜重，g;

0.01—A₄₇₀ 每下降0.01为1个酶活单位，U；

t一反应时间，min。

注意事项

1. 酶的提取、纯化需在低温下进行。

2. H2O2要在反应开始前加，不能直接加入。

3 .酶促反应较快，计时应准确、快速。

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