用测定生成还原糖（葡萄糖和果糖）的量来测定蔗糖水解的速度，本实验中，蔗糖酶的活力单位指在一定条件下反应5 min，每产生1毫克葡萄糖所需酶量。本实验旨在测定各级分的蛋白质含量及蔗糖酶活性。

操作方法

考马斯亮蓝法

原理

用测定生成还原糖( 葡萄糖和果糖) 的量来测定蔗糖水解的速度, 本实验中, 蔗糖酶的活力单位指在一定条件下反应5 min，产生1 毫克葡萄糖所需酶量。用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量, 比活力为每毫克蛋白质的活力单位数。

材料与仪器

蛋白质
乙酸缓冲液 葡萄糖 蔗糖 二硝基水杨酸
分光光度计 水浴锅 试管 保鲜膜

步骤

1.  各级分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ蔗糖酶活性测定

用0.02 mol/ L, pH4.9 乙酸缓冲液(也可以用pH5～6 的去离子水代替) 稀释各级分酶液, 测出酶活合适的稀释倍数:

Ⅰ : 1 000～10 000 倍

Ⅱ : 1 000～10 000 倍

Ⅲ : 100～1 000 倍

以上稀释倍数仅供参考。

按顺序在试管中加入各试剂, 进行测定, 为简化操作可取消保鲜膜封口, 沸水浴加热改为用90～95 ℃ 水浴加热8～10 min。   以5 min 生成的还原糖的毫克数为纵坐标, 以试管中1ml 反应混合物中的酶浓度( mg蛋白/ml) 为横坐标, 画出反应速度与酶浓度的关系曲线。

2.  计算各级分的比活力、纯化倍数及回收率

蛋白质含量测定同蛋白质系列实验三。为了测定和计算下面纯化表中的各项数据, 对各个级分都必须取样, 每取一次样, 对于下一级分来说会损失一部分量, 因而要对下一个级分的体积进行校正, 以使回收率的计算不致受到不利的影响。

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