本文依据Unoh等发表于《Journal of Medicinal Chemistry》的原始研究论文，以及蛋白质结构数据库（Protein Data Bank，PDB）收录的共晶结构7VTH和7VU6，介绍S-217622的发现过程。文章重点分析研究人员如何结合药效团筛选、共晶结构解析、结构优化以及药物代谢与药代动力学评价，将微摩尔级命中化合物优化为具有口服给药潜力的临床候选化合物。[1–3]

1 研究目标：获得非肽类、非共价的口服3CL蛋白酶抑制剂

1.1 3CL蛋白酶在病毒复制中的作用

        严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）进入宿主细胞后，其基因组首先翻译生成多聚蛋白1a（pp1a）和多聚蛋白1ab（pp1ab）。

        3C样蛋白酶（3C-like protease，3CL^pro），又称主蛋白酶（main protease，M^pro），负责切割pp1a和pp1ab中的11个位点，参与释放病毒复制所需的非结构蛋白。抑制3CL^pro可减少成熟非结构蛋白的生成，干扰复制—转录复合体的形成，从而抑制病毒RNA复制。[1]

        3CL^pro的催化中心由His41和Cys145组成催化二联体，其底物结合区域包括S1、S2和S1′等亚口袋。不同亚口袋分别识别底物或抑制剂中的特定结构片段，并共同决定配体的结合方向和稳定性。

1.2 为什么研究非共价抑制剂

        早期报道的多种3CL^pro抑制剂采用肽模拟结构，并含有能够与Cys145反应的亲电基团。这类化合物可通过共价键增强靶点结合，但肽样结构可能不利于细胞膜通透性和口服药代动力学性质；反应性基团还需要评估脱靶共价反应的可能性。

S-217622项目主要围绕以下三个方向开展：

1. 采用非肽类小分子结构，降低对肽样骨架的依赖；

2. 通过氢键、疏水作用和芳香相互作用抑制3CL^pro，不依赖与Cys145形成共价键；

3. 在提高酶抑制活性的同时，兼顾细胞抗病毒活性、代谢稳定性和口服药代动力学性质。

非共价抑制剂不能利用共价键提供额外的结合稳定性，因此需要通过多个方向明确、距离合适的非共价相互作用稳定占据蛋白结合口袋。[1]

2 命中化合物发现：将蛋白结合特征转化为筛选条件

2.1 三个关键药效团特征

研究人员分析已知3CL^pro抑制剂及底物的结合方式，将蛋白活性位点中的关键识别特征归纳为三个药效团条件。

        这些条件没有限定候选分子采用特定化学骨架，而是规定了化合物进入3CL^pro结合口袋后需要满足的主要空间和相互作用特征。

        研究团队以3CL^pro与非共价抑制剂的复合物结构为基础，对内部化合物库中的数十万种化合物进行分子对接。符合药效团要求且对接评分较高的300个化合物进入后续生化检测。[1]

2.2 采用质谱法进行酶活性筛选

        初筛采用基于质谱的酶活性检测方法，而不是仅依赖荧光报告体系。

        部分化合物可能通过自身荧光、荧光淬灭、聚集或其他方式干扰光学检测，产生表观抑制活性。质谱法直接检测底物和酶切产物的变化，有助于减少光学干扰造成的假阳性。

        筛选获得了若干半数抑制浓度（half-maximal inhibitory concentration，IC₅₀）低于10 μmol/L的命中化合物。其中，化合物1对3CL^pro的IC₅₀为8.6 μmol/L。[1]

3 先导化合物选择：同时考察活性和药代动力学基础

3.1 化合物1为何值得继续优化

        化合物1的酶抑制活性处于微摩尔水平，但其药物代谢与药代动力学（drug metabolism and pharmacokinetics，DMPK）数据表现出较好的优化基础。

        肝微粒体稳定性可用于评价化合物对部分肝脏代谢酶介导转化的敏感程度。较高的剩余率表明化合物1在相应体外体系中的代谢速度较慢。

        较低的体内清除率有利于维持系统暴露。实验测得的口服生物利用度超过100%属于药代动力学实验中的表观估计结果，可能受到静脉和口服给药实验差异、取样误差及清除率估算等因素影响，不代表实际吸收量超过给药量。

        化合物1的主要价值在于其已经具有较好的代谢稳定性、较低的体内清除率和口服暴露。研究人员因此将后续优化重点放在增强靶点结合，同时持续观察DMPK性质是否受到不利影响。[1]

3.2 先导化合物需要综合评价

口服候选化合物的选择不能仅依据IC₅₀排序，还需要综合考察以下因素：

①能否进入病毒感染细胞并到达细胞内靶点；

②经口给药后能否形成适当的系统暴露；

③体内代谢和清除速度是否适宜；

④对其他蛋白酶是否具有一定选择性；

⑤化学结构是否便于继续修饰和制备类似物。

因此，先导化合物选择是对靶点活性、代谢稳定性、清除率、口服暴露和结构可修饰性的综合判断。

4 共晶结构分析：确定结合基础和可优化区域

4.1 化合物1的结合模式

研究人员解析了化合物1与3CL^pro的X射线共晶结构，PDB编号为7VTH，分辨率为2.00 Å。[2]

化合物1含有1,3,5-三嗪-2,4-二酮核心。共晶结构显示，该核心不仅连接不同取代基，其两个羰基还直接参与蛋白结合：

①一个羰基与Glu166主链NH形成氢键；

②另一个羰基位于氧阴离子孔，与Gly143和Cys145的主链NH形成氢键；

③指向S1口袋的甲基酰胺羰基与His163侧链NH形成氢键；

④化合物1中的3,4,5-三氟苄基片段占据S2疏水口袋；

⑤指向S1′区域的醚氧与Thr26主链NH形成氢键。

这些相互作用共同稳定化合物1在3CL^pro活性位点中的结合构象。[1,2]

4.2 His41侧链构象变化形成芳香相互作用

        分子对接模型预测，化合物1中3,4,5-三氟苄基片段的芳环可与His41形成芳香相互作用。共晶结构进一步显示，His41侧链发生构象调整，使其咪唑环与该芳环形成面对面的π–π相互作用。

        这一结果表明，3CL^pro结合口袋并非完全刚性。配体进入活性位点后，部分氨基酸侧链可以调整构象，从而形成静态对接模型未能充分描述的相互作用。

共晶结构由此提供了两类关键依据：

1. 确认哪些氢键和疏水相互作用真实存在并应在后续设计中保留；

2. 识别尚未得到充分利用的蛋白空间，为取代基优化提供方向。

5 结构优化：分别改善S1和S1′区域的匹配

5.1 保留中心骨架和关键结合相互作用

        后续优化保留了1,3,5-三嗪-2,4-二酮核心，以及共晶结构中已经确认的主要氢键和S2芳香相互作用。

        研究人员主要优化指向S1和S1′区域的外围取代基，同时延续以三氟苄基片段占据S2口袋的设计思路，并对芳环上的氟取代位置进行调整。化合物1含有3,4,5-三氟苄基片段，而最终获得的S-217622含有2,4,5-三氟苄基片段。

5.2 S1′区域优化：引入氯代甲基吲唑

        化合物1指向S1′区域的取代基为4-二氟甲氧基-2-甲基苯基。研究人员对该区域进行结构替换，在化合物2中引入6-氯-2-甲基-2H-吲唑基团。

该结构在结合口袋中可形成以下相互作用：

①吲唑氮与Thr26主链NH形成氢键；

②6-氯-2-甲基-2H-吲唑片段与Met49形成疏水接触；

③整体形状与S1′区域的空间匹配得到改善。

化合物2的酶抑制活性较化合物1提高约90倍，同时保持了较好的DMPK性质。[1]

5.3 S1口袋优化：用甲基三唑替代甲基酰胺

在S1区域，研究人员以不同含氮杂环替换化合物2中的甲基酰胺，最终选择1-甲基-1H-1,2,4-三唑。

S-217622在原论文中编号为化合物3。其与3CL^pro的共晶结构编号为7VU6，分辨率为1.80 Å。[1,3]

S-217622的主要结合关系可简化表示为：

S1口袋

1-甲基-1H-1,2,4-三唑-3-基甲基片段中的三唑环N ──氢键── His163侧链NH

S2口袋

2,4,5-三氟苄基片段占据S2疏水口袋，其中的三氟取代苯环与His41咪唑环形成π–π相互作用。 

S1′区域

6-氯-2-甲基-2H-吲唑片段占据S1′区域，其中吲唑环N1作为氢键受体，与Thr26主链NH形成氢键；该片段的氯取代芳香区域与Met49侧链形成疏水接触。

中心区域

1,3,5-三嗪-2,4-二酮骨架的一个羰基与Glu166主链NH形成氢键；另一个羰基伸入氧阴离子孔，与相关主链酰胺NH形成氢键网络 

三个外围结构分别朝向不同结合区域，中心三嗪二酮骨架则控制各取代基的空间方向，并参与蛋白主链氢键网络。

S-217622通过上述非共价相互作用占据3CL^pro活性位点，不与催化残基Cys145形成共价键。

6 从酶抑制活性到口服候选化合物

6.1 生化活性与细胞抗病毒活性

S-217622对3CL^pro的IC₅₀为0.013 μmol/L。与IC₅₀为8.6 μmol/L的化合物1相比，其酶抑制活性提高约660倍。

在SARS-CoV-2感染细胞的细胞病变效应实验中，S-217622的半数有效浓度（half-maximal effective concentration，EC₅₀）为0.37 μmol/L。[1]

IC₅₀和细胞EC₅₀评价的是不同层面的性质：

        化合物在细胞体系中还会受到膜通透性、培养基蛋白结合、细胞内非特异性结合、代谢和外排等因素影响。因此，酶IC₅₀与细胞EC₅₀不宜直接等同。

6.2 药代动力学性质

S-217622在提高酶抑制活性的同时，保持了较高的微粒体稳定性，并进一步降低了大鼠体内清除率。

        原论文还报告，S-217622在所测试动物中具有较高的口服生物利用度。猴和犬中的较长消除半衰期，为进一步研究每日一次口服给药方案提供了药代动力学依据。[1]

        这些结果说明，结构优化不仅提高了靶点抑制活性，还保持了代谢稳定性和口服吸收，并降低了大鼠体内清除率。

7 抗病毒范围与蛋白酶选择性

7.1 对不同SARS-CoV-2变异株的活性

        S-217622在原论文测试的多种SARS-CoV-2变异株中表现出相近的细胞抗病毒活性，EC₅₀范围为0.29～0.50 μmol/L，其中包括研究当时检测的Omicron变异株。[1]

        S-217622作用于3CL^pro，而不是刺突蛋白受体结合区域。原论文测试的变异株没有对S-217622依赖的主要活性位点相互作用产生明显影响，因此化合物在这些实验中保持了相近活性。

        该结论限于原论文检测的病毒株和实验条件，不宜直接外推至未进行实验评价的后续变异株。

7.2 对其他冠状病毒的体外活性

原论文还评价了S-217622对其他冠状病毒的体外活性。

        其中，EC₉₀表示产生90%抑制效应所需的药物浓度。不同病毒实验使用的细胞、检测方法和评价终点并不完全相同，因此这些数值主要说明S-217622具有一定的冠状病毒谱体外活性，不宜据此进行简单的横向强弱排序。[1]

7.3 对其他蛋白酶的选择性

        在最高测试浓度100 μmol/L下，S-217622对研究中检测的多种人源蛋白酶及人类免疫缺陷病毒1型（human immunodeficiency virus type 1，HIV-1）蛋白酶均未达到50%抑制，包括：

①caspase-2；

②胰凝乳蛋白酶；

③组织蛋白酶B、D、G和L；

④凝血酶；

⑤HIV-1蛋白酶。

这些结果支持S-217622对冠状病毒3CL蛋白酶具有一定的酶学选择性，但不能替代更广泛的脱靶评价、安全药理研究和毒理学研究。[1]

8 小鼠体内药效：血浆暴露与肺部病毒滴度下降相关

        研究人员在感染SARS-CoV-2 Gamma株的BALB/c小鼠模型中评价S-217622的体内抗病毒作用。

        小鼠在感染后立即以及感染后12小时分别口服给药一次，剂量为2、8、16或32 mg/kg；感染后24小时检测肺组织病毒滴度。

实验结果显示：

①S-217622剂量依赖性降低肺部病毒滴度；

②16和32 mg/kg组的平均病毒滴度接近实验定量下限；

③血浆药物浓度随给药剂量增加而升高；

④在不低于16 mg/kg的剂量下，模拟血浆浓度在较长时间内高于经蛋白结合校正的细胞EC₅₀。

        该实验表明，S-217622的血浆暴露增加与肺部病毒滴度下降具有一致的剂量变化趋势，为其体内抗病毒作用提供了药效学证据。[1]

需要区分的是，小鼠药效实验采用间隔12小时的两次给药方案；原论文提出的每日一次口服给药潜力，主要来自猴和犬的药代动力学结果，而不是由该小鼠给药方案单独证明。

9 发现阶段合成路线：支持类似物制备与构效关系研究

9.1 S-217622的合成路线

原论文从已知的3-叔丁基-6-(乙硫基)-1,3,5-三嗪-2,4-二酮9出发，经过四步反应制得S-217622。[1]

化合物9

  │ 1-(溴甲基)-2,4,5-三氟苯

  │ 碳酸钾，乙腈，80 ℃

  │ 收率93%

  ▼

化合物10：引入2,4,5-三氟苄基

  │ 三氟乙酸，室温

  │ 收率97%

  ▼

化合物11：脱除叔丁基

  │ 3-(氯甲基)-1-甲基-1H-1,2,4-三唑盐酸盐

  │ 碳酸钾，N,N-二甲基甲酰胺，60 ℃

  │ 收率45%

  ▼

化合物12：引入1-甲基-1H-1,2,4-三唑-3-基甲基片段 

  │ 6-氯-2-甲基-2H-吲唑-5-胺

  │ 六甲基二硅基氨基锂，四氢呋喃

  │ 0 ℃至室温

  │ 收率25%

  ▼

S-217622

路线中常用缩写如下：

· MeCN：乙腈（acetonitrile）；

· TFA：三氟乙酸（trifluoroacetic acid）；

· DMF：N,N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide）；

· LHMDS：六甲基二硅基氨基锂，又称双(三甲基硅基)氨基锂（lithium bis(trimethylsilyl)amide）；

· THF：四氢呋喃（tetrahydrofuran）。

S-217622还可与富马酸在乙酸乙酯中形成1∶1富马酸盐，原论文报告该成盐步骤的分离收率为95%。[1]

9.2 末步反应的化学本质

        化合物12的三嗪环上含有乙硫基，该基团可在亲核取代过程中作为离去基团。LHMDS可使6-氯-2-甲基-2H-吲唑-5-胺发生去质子化或显著提高其有效亲核性，所得含氮亲核体进攻缺电子的三嗪环碳，随后经加成—消除过程取代乙硫基。

        该反应属于缺电子含氮杂环上的亲核取代。三嗪二酮体系中的环氮和羰基有助于提高相应环碳的亲电性，使胺类亲核试剂能够完成取代反应。

原论文主要报告反应条件、产物结构和分离收率，没有对该步骤的详细反应动力学或中间体进行专门研究。

9.3 发现路线的主要用途

从路线结构看，指向S1、S2和S1′区域的三个外围片段分步引入，有利于制备结构类似物并开展构效关系研究：

        原论文披露的甲基三唑甲基片段引入步骤收率为45%，末步吲唑胺取代反应收率为25%，部分中间体和最终产物采用硅胶柱层析纯化。因此，这条路线主要用于药物发现阶段的候选化合物及类似物制备。

        生产工艺还需要进一步评价原料供应、杂质形成与清除、结晶分离、操作安全、设备适配性和批次重现性。

10 S-217622发现过程的关键决策

S-217622的发现过程可归纳为五个连续阶段。

这一研究过程形成了由生化活性、共晶结构、细胞抗病毒活性、DMPK性质和小鼠体内药效组成的连续证据链，分别回答了三个层面的问题：

1. 化合物能否以明确的非共价方式抑制3CL^pro；

2. 化合物能否在感染细胞中抑制病毒复制；

3. 经口给药后能否形成支持体内抗病毒作用的药物暴露。

11 S-217622合成、盐型与分析研究相关化学品

表1 目标化合物、盐型及关键反应试剂

表2 反应、萃取、成盐及分离用溶剂

表3 后处理、制备分离及分析辅助材料

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参考文献

[1] Unoh Y, Uehara S, Nakahara K, et al. Discovery of S-217622, a noncovalent oral SARS-CoV-2 3CL protease inhibitor clinical candidate for treating COVID-19. Journal of Medicinal Chemistry. 2022;65(9):6499–6512. doi:10.1021/acs.jmedchem.2c00117.

[2] Yamamoto S, Tachibana Y. The crystal structure of SARS-CoV-2 3CL protease in complex with compound 1. Protein Data Bank. PDB ID: 7VTH. Released April 6, 2022. doi:10.2210/pdb7VTH/pdb.

[3] Yamamoto S, Yamane J, Tachibana Y. The crystal structure of SARS-CoV-2 3CL protease in complex with compound 3. Protein Data Bank. PDB ID: 7VU6. Released April 6, 2022. doi:10.2210/pdb7VU6/pdb.

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