已有一种方法可用来从 SDS-PAGE 凝胶中提取完整蛋白质并对其进行 MALDI-TOF MS 分析，以确定其分子质量。这种方法包括一个电洗脱步骤以及在 MALDI-TOF 质谱分析之前的一个低温基质/ 分析物共结晶步骤。本实验来源「植物蛋白质组学实验指南」〔法〕H.蒂勒门特、M.齐维、C.达默韦尔、V.米琴主编。

操作方法

完整蛋白质从SDS-PAGE胶中的电洗脱及其MALDI-TOFMS分析

材料与仪器

电泳缓冲液 蛋白质染色液 微量离心管
水平凝胶电泳仪器 电洗脱试剂盒 真空离心浓缩仪

步骤

3.1 蛋白质检测

一 般而言，凝胶染色和脱色非常易于操作。在本实验方法中，我们使用 ElectroBlue 染料代替有固定作用的考马斯亮蓝染色液显色蛋白质（见注释 1) 。

( 1 ) SDS-PAGE 电泳后，用 300 ml Milli-Q 水或去离子水漂洗凝胶（8 cm X 10 cm ) 3 次，每次 10 min。

( 2 ) 用 ElectroBlue 染料给凝胶染色，用大约 20 ml 染色液浸泡凝胶（8 cm X 10 cm)，缓慢摇动 2 h ( 见注释 3 )。

( 3 ) 用 300 mL Milli-Q 水或去离子水漂洗凝胶脱色，直至达到所需的凝胶背景。每 30 min 换一次水。

3.2 电洗脱

( 1 ) 将电洗脱管垂直向上放置，加入 0.8 ml Milli-Q 水或去离子水，盖上盖。等待 10 min 并检查是否漏液。倒空管内液体（见注释 4) 。

( 2 ) 用一个干净，锋利的直刃剃刀将蛋白质条带从染色的凝胶上切下来，用一字镊子将凝胶碎片转移至电洗脱管中，在管中加入 1X 电泳缓冲液（0.8 ml) ，轻轻盖上盖，小心地将管安放在电洗脱仪的支持盘上，这样电流就可以直接通过两个薄膜窗（见注释 5 ) 。

( 3 ) 向电泳槽内灌入 1X 电泳缓冲液并将电洗脱支持盘放入槽内，确保电洗脱管完全浸泡在电泳缓冲液中，而且每根管的薄膜与电场垂直。

( 4 ) 120 V 电泳洗 2 h（见注释 6) 。

( 5 ) 电泳结束后，翻转正负极，并在相同电压下电泳 30~60 s ( 见注释 7) 。

( 6 ) 用镊子将凝胶碎片从电洗脱管中取出。轻轻盖上盖，将管子放回支持盘中。

( 7 ) 将支持盘放入盛有所需缓冲液或酸化水（1% 蚁酸）的 2 L 烧杯中。4°C 过夜透析，期间更换一次缓冲液。

( 8 ) 透析完成后，将蛋白质溶液转移至 1.5 mL 微量离心管中，用真空离心浓缩仪 ( SpeedVac) 浓缩至 5 μL 左 右 （见注释 8) 。

( 9 ) 将浓缩后的蛋白质溶液（1 μl ) 与基质溶液（1 μl，芥子酸，10 mg/ml 溶于 30% 乙腈）混合在 150 μl 微量离心管中，盖紧盖后 4°C 放置过夜，让蛋白质和基质共结晶（见注释 9) 。

( 10 ) 轻轻打开微量离心管盖并用 2 μl 移液器除去上清液。向管中加入 1 μl 基质溶液以重悬晶体，涡旋振荡，然后将其点样在 MALDI 样品板上（见注释 10)。

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