本实验来源「细胞实验指南」 黄培堂 等译。

操作方法

耐热四膜虫的电穿孔转化

材料与仪器

抗生素抗性细胞
Tris 抗生素复合物 HEPES
烧瓶 Cormung 塑料圆锥形试管

步骤

1. 培养适当的 2 种不同交配型的抗生素抗性细胞到对数期。

2. 以约 2X10⁵ 细胞/ml，在 10 mmol/L pH 7.5 的 Tris 中洗涤细胞，常规交配使细胞饥饿 6~24 小时。

3. 检测每种交配型细胞密度，调为 3X10⁵ 细胞/ml。在烧瓶中混合等量的相反交配型的细胞，体积适当，以确保固定时通气量合适。

4. 添加抗生素复合物，用铝箔或棉絮塞子盖上烧瓶。

5. 开始交配，让细胞在 30℃ 静置。

6. 4~6 小时后，检测交配效率。如细胞配对超过 80%，接着进行转化步骤。

7. 交配 10 小时后，将细胞转到 50 ml 的 Cormung 塑料圆锥形试管中，用 pH 7.5 的 10 mmol/L HEPES 轻轻洗涤细胞。

8. 在 10 mmol/L HEPES 中重悬细胞到约 3X10⁷ 细胞/ml。

9. 在 HEPES 缓冲液中混合 125 μl 细胞和 125 μl 准备好的质粒 DNA，立即进行电穿孔。

10. 用 0.2 cm 的样品池，电压设为 250 V，电容 275 mF，电阻 13 欧姆。

11. 在室温下样品池静置 1 分钟，然后用添加了抗生素混合物的在 20 ml SPP 中重悬细胞。

12. 用 SPP 系列稀释细胞，将 25 ml 加到含有添加了抗生素混合物的 175 μl SPP 的 96 孔微量滴定板中。

13. 12~18 小时后，在所选的每个转化孔中加入 50 μl 巴龙霉素，600 μg/ml 10 mmol/L HEPES，或另一种抗生素。

14. 4~5 天后，用 Poisson 分布计算转化产量。

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