血脑屏障通透性评价用于判断脑微血管内皮屏障是否受损、药物或示踪分子能否进入脑组织，以及炎症、缺血、肿瘤或递送系统是否改变脑血管屏障功能。实验设计不能只看“脑内信号升高”，还需要结合示踪剂分子量、血管灌流、组织背景、TEER、Papp 和紧密连接标志物综合判读。

关键词：血脑屏障；BBB通透性；示踪剂外渗；TEER；Papp；紧密连接蛋白；脑微血管内皮细胞

1 血脑屏障通透性评价的研究逻辑

1.1 血脑屏障的结构基础

（1）脑微血管内皮细胞

        脑微血管内皮细胞是血脑屏障的核心细胞层，具有连续紧密连接、低胞吞活性和高度极化的转运体系。通透性评价首先要判断内皮屏障是否被破坏，而不是只把脑组织中检测到的示踪信号理解为“进入脑实质”。

（2）紧密连接和黏附连接

        Claudin-5、Occludin、ZO-1、JAM-A 和 VE-cadherin 等连接分子维持内皮细胞间屏障完整性。若小分子示踪剂外渗增加，同时伴随 Claudin-5 或 ZO-1 连续性下降，更支持细胞旁通路开放；若连接蛋白形态基本完整而特定药物进入增加，则需考虑转运体、胞吞或载体递送机制。

（3）神经血管单元

        血脑屏障不是单一内皮结构，还包括周细胞、星形胶质细胞足突、基底膜、微胶质细胞和神经元信号调节。炎症、缺血再灌注、脑肿瘤和神经退行性疾病中，通透性变化常与细胞因子、基底膜重塑、内皮激活和胶质反应共同发生。

1.2 通透性评价需要回答的问题

（1）屏障是否破坏

        屏障破坏通常表现为血管内示踪剂进入脑实质、血浆蛋白外渗、TEER 下降、Papp 升高和紧密连接连续性中断。应同时关注阳性区域的血管位置和组织背景，避免把血管内残留信号误判为外渗。

（2）通透性改变发生在哪一类分子

        不同示踪剂反映不同尺度的屏障开放。小分子荧光素钠可反映早期或轻度通透性升高；FITC-dextran 4 kDa、10 kDa、40 kDa 或 70 kDa 可用于区分不同分子量范围的渗漏；Evans blue 与血清白蛋白结合后更适合评价大分子血浆蛋白样外渗。

（3）通透性改变是否具有功能意义

        脑内示踪剂升高并不一定代表药物有效递送，也不一定说明屏障严重损伤。需要结合神经炎症、脑水肿、神经功能评分、药物脑/血浓度比、转运体表达和组织定位判断其生物学意义。

表1 血脑屏障通透性评价的核心检测框架

2 体内血脑屏障通透性评价

2.1 示踪剂外渗实验

（1）Evans blue 外渗

        Evans blue 与血清白蛋白结合后主要反映白蛋白样大分子外渗，适合评价较明显的血脑屏障破坏。实验中需在处死前充分心脏灌流，去除血管腔内残留染料；若灌流不足，脑组织蓝染或荧光信号可能主要来自血管内残留，而非真实外渗。

（2）荧光素钠外渗

        荧光素钠分子量较小，对轻度屏障通透性变化较敏感，适合早期损伤、炎症刺激或药物干预后屏障微弱开放的评价。由于小分子扩散快、组织背景和肾清除影响较明显，检测时应固定注射剂量、循环时间、灌流方式和组织取样区域。

（3）FITC-dextran 分子量梯度

        FITC-dextran 可按不同分子量选择，用于判断屏障开放程度。低分子量 dextran 更容易检测到轻度渗漏，高分子量 dextran 更适合判断严重屏障破坏或血管结构损伤。若 4 kDa 示踪剂升高而 70 kDa 未升高，通常提示屏障轻度开放；若多种分子量均明显外渗，则需考虑更严重的血管屏障损伤。

2.2 组织成像与定量

（1）脑区定位

        血脑屏障通透性具有明显脑区差异。缺血模型常在梗死边缘区、皮层或纹状体出现局部外渗；脑肿瘤模型中通透性升高多与肿瘤血管异常相关；炎症模型则可能出现弥散性或脑区选择性改变。定量时应预先定义 ROI，避免只选择信号最强区域造成偏倚。

（2）血管内外区分

        切片成像应联合血管标志物，如 CD31、Lectin 或 Collagen IV，判断示踪剂信号位于血管腔内、血管壁周围还是脑实质。只做整脑匀浆定量可以提高通量，但无法区分血管残留和真正跨屏障外渗，因此最好与组织切片定位联合使用。

（3）信号归一化

        体内外渗结果可按脑组织重量、蛋白量、注射剂量或血浆示踪剂浓度校正。若不同动物循环血药浓度差异较大，仅比较脑组织荧光强度可能不准确。药物递送研究中，脑/血浓度比或脑组织 AUC 更适合反映跨屏障暴露。

2.3 动态影像评价

（1）MRI 对比剂渗漏

        含钆对比剂动态增强 MRI 可用于无创评价血脑屏障破坏，适合纵向观察脑肿瘤、脑缺血、炎症和治疗干预。该方法可提供空间分布和动态参数，但对建模、血管输入函数和组织灌注状态较敏感。

（2）双光子和活体成像

        双光子显微成像可在活体水平观察示踪剂从脑微血管向周围组织外渗的过程，适合研究微血管局部通透性和动态开放。该方法空间分辨率高，但视野有限、操作要求高，通常用于机制研究而非大样本筛选。

（3）近红外或荧光整体成像

        近红外探针或荧光纳米材料可用于整体成像和药物递送评价。由于头皮、颅骨、组织散射和血液残留会影响信号，结果应结合离体脑成像、组织切片或定量检测确认。

表2 体内 BBB 通透性示踪剂选择

3 体外血脑屏障模型评价

3.1 常用模型类型

（1）Transwell 单层模型

        Transwell 模型通过脑微血管内皮细胞形成屏障层，可用于 TEER、Papp 和药物跨膜转运检测。该模型操作相对标准化，适合筛选和机制研究，但单一内皮模型难以完全模拟星形胶质细胞、周细胞和剪切力对 BBB 表型的调节。

（2）共培养模型

        内皮细胞与星形胶质细胞、周细胞或神经元共培养可更接近神经血管单元环境。共培养通常能提高紧密连接成熟度和屏障电阻，但细胞比例、接种顺序、培养基兼容性和细胞来源会显著影响结果。

（3）微流控 BBB 芯片

        微流控芯片可引入流体剪切力、三维结构和多细胞相互作用，更适合评价动态通透性、药物递送和炎症细胞黏附。该模型生理相关性较高，但平台差异大、操作门槛高，结果转化为常规 Papp 或 TEER 指标时需要额外校正。

3.2 TEER 检测

（1）屏障电阻读数

        TEER 反映细胞层对离子通行的阻抗，是体外 BBB 模型完整性评价的常用指标。TEER 升高通常提示细胞间连接更紧密，TEER 下降则提示细胞间屏障受损、细胞死亡或连接结构松散。

（2）面积校正

        TEER 应扣除空白膜电阻，并按膜面积换算为 Ω cm²。不同孔径、膜材质、插入杯面积和电极类型会影响绝对值，因此不同模型之间不宜直接比较未校正 TEER。

（3）与通量实验联用

        TEER 主要反映离子通透性，不能完全代表药物或大分子跨膜通透性。某些处理可降低 TEER 但不显著改变大分子通量，也可能不影响 TEER 却改变转运体介导的药物通行。因此 TEER 应与荧光示踪剂或目标药物 Papp 联合评价。

3.3 Papp 与示踪剂跨膜实验

（1）Papp 计算

        Papp 用于评价化合物或示踪剂通过细胞屏障的表观通透性，通常根据受体侧浓度变化、供体侧初始浓度、膜面积和时间计算。实验需保证供体侧浓度稳定、受体侧采样体积准确，并确认通量处于线性时间段。

（2）示踪剂选择

        Lucifer yellow、荧光素钠、FITC-dextran 和放射性蔗糖等可用于体外模型通透性评价。小分子示踪剂适合检测轻微屏障缺陷，dextran 类示踪剂适合评价分子量依赖性通透性。若研究药物递送，应同时检测目标药物本身，而不是只用示踪剂替代。

（3）回收率与质量平衡

        Papp 实验应记录供体侧、受体侧和细胞/膜结合部分的质量平衡。若回收率过低，可能存在化合物吸附、降解、细胞摄取或膜材料结合，直接用受体侧信号计算通透性会低估真实转运情况。

表3 体外 BBB 模型与通透性评价方法比较

4 紧密连接和内皮表型分析

4.1 紧密连接标志物

（1）Claudin-5

        Claudin-5 是 BBB 内皮紧密连接的重要组成分子，其连续性和边界定位比单纯总表达量更有判读价值。若 Claudin-5 从细胞边界变为断裂、弥散或降低，通常提示屏障结构受损。

（2）Occludin

        Occludin 常用于评估紧密连接稳定性和屏障调节状态。炎症因子、氧化应激和缺血损伤可影响 Occludin 表达或定位。判读时应结合 ZO-1 和 Claudin-5，而不是依赖单一标志物。

（3）ZO-1

        ZO-1 是连接膜蛋白与细胞骨架的重要支架蛋白。ZO-1 免疫荧光可直观显示细胞边界连续性，适合与 TEER 和 Papp 结果联用。若 TEER 下降同时 ZO-1 边界破碎，更支持细胞间连接受损。

4.2 内皮和神经血管单元标志物

（1）内皮标志物

        CD31、VE-cadherin、vWF 和 GLUT1 可用于确认脑微血管内皮细胞特征。体外模型中若内皮标志物不足或细胞形态异常，即使短期 TEER 较高，也不一定代表稳定 BBB 表型。

（2）周细胞和星形胶质细胞标志物

        PDGFRβ、NG2 可用于周细胞分析，GFAP 和 AQP4 可用于星形胶质细胞反应及足突相关研究。体内实验中，AQP4 极化紊乱或 GFAP 升高常提示胶质反应参与 BBB 改变。

（3）基底膜和炎症标志物

        Collagen IV、Laminin、MMP-2 和 MMP-9 可用于评价基底膜结构与降解。ICAM-1、VCAM-1、TNF-α、IL-1β 和 IL-6 可反映内皮炎症激活。若通透性升高伴随 MMP-9 增加和紧密连接断裂，通常提示炎症或基质降解参与屏障破坏。

表4 BBB 通透性评价常用分子标志物

5 不同研究场景中的通透性评价策略

5.1 脑缺血与再灌注

（1）早期通透性升高

        缺血再灌注后 BBB 通透性可出现时间依赖性变化。早期小分子示踪剂外渗增加可能反映内皮应激和紧密连接调节，后期大分子外渗、脑水肿和血浆蛋白沉积则更提示明显屏障破坏。实验应根据模型时间窗选择示踪剂和取样点。

（2）梗死区与半暗带区

        缺血模型中通透性改变常存在空间异质性。梗死核心区可能出现严重血管损伤，半暗带区更适合评价治疗干预对屏障保护的作用。定量时应结合 TTC 染色、脑区分离或影像定位，避免把不同区域混合后稀释差异。

（3）神经保护干预

        若干预组示踪剂外渗减少，同时 Claudin-5/ZO-1 连续性改善、MMP-9 降低和脑水肿减轻，更支持其具有 BBB 保护作用。若只降低荧光信号而不改善结构或功能指标，需要排查干预是否影响示踪剂血浆浓度、循环清除或组织荧光背景。

5.2 神经炎症与感染

（1）炎症因子诱导

        LPS、TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IFN-γ 可诱导内皮激活，增加 ICAM-1、VCAM-1 和趋化因子表达，并影响紧密连接稳定性。体外模型中可用炎症因子刺激后检测 TEER、Papp 和连接蛋白定位，构建炎症性 BBB 损伤模型。

（2）免疫细胞穿越

        神经炎症研究中，通透性评价不应只看分子外渗，还应关注白细胞黏附和跨内皮迁移。可结合内皮黏附分子、趋化因子、免疫细胞标志物和组织定位，判断屏障开放是否伴随免疫细胞进入中枢。

（3）细胞活性控制

        炎症刺激过强会造成内皮细胞死亡，导致 TEER 急剧下降和示踪剂大量通透。此类结果更接近细胞毒性损伤，而不一定代表生理性屏障调节。应同步检测细胞活性、凋亡或膜完整性。

5.3 脑肿瘤和药物递送

（1）血肿瘤屏障

        脑肿瘤区域常存在异常血管和血肿瘤屏障，但通透性并不均一。肿瘤核心、边缘和周围脑组织的血管结构不同，药物或纳米颗粒进入肿瘤组织不能简单外推为正常 BBB 可通行。

（2）递送系统评价

        纳米颗粒、脂质体、外泌体、受体介导转运系统和聚焦超声开放 BBB 等研究，应同时评价递送效率和屏障安全性。理想结果不是单纯“通透性越高越好”，而是在有效脑内递送的同时控制血浆蛋白外渗、炎症反应和神经毒性。

（3）靶向机制区分

        若递送载体脑内信号升高，应区分血脑屏障破坏、受体介导转胞吞、血管内滞留和细胞摄取。可通过灌流、血管共定位、受体阻断、脑实质定位和脑/血浓度比综合判断。

6 实验设计与质量控制

6.1 体内实验控制点

（1）灌流充分性

        灌流是体内通透性实验的关键步骤。灌流不足会使血管腔内示踪剂残留，导致脑组织信号假性升高。应统一灌流液类型、灌流体积、灌流速度和终点判断，并在必要时用血管标志物或残留血红蛋白检测评估灌流效果。

（2）循环时间

        不同示踪剂的血浆半衰期、分布速度和组织外渗速度不同。循环时间过短可能低估通透性，过长则可能增加清除差异和组织扩散背景。应根据示踪剂分子量和模型损伤程度预实验确定合适时间窗。

（3）脑区取样

        全脑匀浆适合整体定量，但可能掩盖局部通透性变化。区域性疾病模型应分离皮层、海马、纹状体、肿瘤区或损伤侧/对侧组织，并结合成像定位确认信号来源。

6.2 体外实验控制点

（1）细胞单层完整性

        进行通透性实验前应确认细胞达到融合并形成稳定屏障。若细胞层存在孔洞、边缘脱落或密度不均，Papp 升高可能只是模型失败。应在实验前记录显微镜形态和 TEER 基线。

（2）示踪剂浓度与采样时间

        示踪剂浓度过高可能增加背景或改变渗透压，采样时间过长可能进入非线性阶段。应先建立时间-通量曲线，选择线性范围内的时间点计算 Papp。

（3）细胞毒性排查

        处理药物或刺激条件可能直接损伤内皮细胞。若 TEER 下降、Papp 升高同时细胞活性明显下降，应将结果解释为细胞损伤相关屏障破坏，而不是特异性调节 BBB 通透性。

6.3 数据判读误区

（1）只看单一示踪剂

        单一示踪剂只能反映特定分子量或特定读数窗口。若研究屏障开放程度，最好联合小分子和大分子示踪剂；若研究药物递送，应检测目标药物本身，并用示踪剂作为屏障状态参考。

（2）只看总蛋白表达

        紧密连接蛋白总量不变，不代表屏障结构完整。连接蛋白从细胞边界移位、断裂或内吞，也会造成通透性升高。因此 IF 或多重成像中的定位信息通常比单纯 Western blot 更能解释屏障结构变化。

（3）把脑内信号等同于脑实质进入

        脑组织信号可能来自血管内残留、血管壁结合、脑膜、脉络丛、室管膜区域或非特异组织吸附。药物递送和纳米材料研究尤其需要通过灌流、血管共定位和细胞定位确认脑实质分布。

表5 BBB 通透性实验常见异常与优化方向

7 血脑屏障通透性评价相关试剂与材料选型

表6 常用示踪剂、对照试剂与检测材料

8 常见问题

8.1 血脑屏障通透性评价应该优先选 Evans blue 还是 FITC-dextran？

        取决于研究问题。Evans blue 更适合判断白蛋白样大分子外渗和较明显 BBB 破坏；FITC-dextran 可通过不同分子量判断屏障开放尺度。若研究轻度或早期通透性升高，可优先考虑荧光素钠或低分子量 FITC-dextran。

8.2 为什么体内 BBB 外渗实验必须灌流？

        灌流用于去除血管腔内残留示踪剂。若灌流不足，脑组织荧光或染料提取信号会被血管内残留显著放大，导致假阳性。通透性研究中，灌流标准化通常与示踪剂选择同样重要。

8.3 TEER 下降是否一定说明血脑屏障通透性增加？

        不一定。TEER 主要反映离子通透性和细胞层电阻，不能完全代表大分子或药物通量。TEER 下降应与 Papp、示踪剂跨膜、紧密连接成像和细胞活性检测联合判读。

8.4 Papp 升高是否说明药物可以有效进入脑组织？

        不能直接说明。Papp 反映体外模型跨膜通透能力，但脑内递送还受血流、血浆蛋白结合、转运体外排、代谢、脑实质扩散和组织结合影响。药物递送研究需要进一步检测脑/血药物浓度比和脑内空间分布。

8.5 Claudin-5 或 ZO-1 总蛋白不下降，为什么通透性仍然升高？

        紧密连接功能不仅取决于总蛋白量，还取决于细胞边界定位、连续性、磷酸化状态和与细胞骨架的连接。若蛋白总量不变但免疫荧光显示边界断裂或弥散，仍可出现通透性升高。

8.6 体外 BBB 模型中 TEER 值越高越好吗？

        TEER 高通常提示屏障较紧密，但过高或异常稳定的数值不一定代表真实 BBB 功能。应同时确认内皮表型、紧密连接定位、示踪剂低通透性、细胞活性和转运体功能，避免只用 TEER 单一指标评价模型质量。

8.7 荧光示踪剂脑内信号升高如何区分血管内残留和脑实质进入？

        应结合充分灌流、血管标志物共染、组织切片定位和三维成像分析。若示踪信号主要与 CD31 或 Lectin 阳性血管重叠，更可能是血管内残留或血管壁结合；若信号位于血管外并向周围实质扩散，才更支持跨 BBB 外渗。

8.8 做 BBB 药物递送研究时，是否只需要检测示踪剂外渗？

        不够。示踪剂外渗只能说明屏障状态或模型通透性变化，不能替代目标药物检测。递送研究应同时检测目标药物脑内浓度、血浆浓度、脑区分布、细胞定位和安全性指标，并区分主动递送、屏障破坏和血管滞留。

        血脑屏障通透性评价应从示踪剂选择、血管灌流、体外屏障模型、紧密连接结构和数据校正几个层面同时设计。可靠的结果不是单一荧光信号升高，而是外渗定位、TEER/Papp 变化、连接蛋白重塑和样本基质控制共同支持同一结论。

更多相关文章，详见下方：

[1] 血脑屏障体外模型的建立

[2] 血脑屏障通透性检测