背景与原理

外泌体是直径约30至150 nm的小型细胞外囊泡（EV），几乎由所有细胞类型分泌至胞外空间。它们携带来自亲代细胞的蛋白质、脂质、mRNA、microRNA及其他非编码RNA等货物，反映亲代细胞的生理或病理状态，因此在生物标志物发现、液体活检及细胞通讯研究中具有重要价值。

传统的差速超速离心法耗时较长，需要专用设备，且实验室间结果差异较大。Exosome Isolation Kit（E771324）采用聚合物沉淀策略，通过减少囊泡周围的水化层使其在较低离心力（低至1,500 × g）下沉淀。所得沉淀物可重悬于与多种下游分析技术兼容的缓冲液中。

由于细胞培养条件培养基和尿液在蛋白质含量、体积及渗透压方面存在显著差异，建议针对每种基质分别采用优化方案，以确保最大回收率和纯度。

样品制备

细胞培养条件培养基：

• 在标准条件下培养细胞。进行外泌体研究时，应在细胞培养前通过超速离心（100,000 × g，4 °C，≥18 h）去除血清补充剂中的外泌体，或使用市售外泌体去除FBS。
• 在所需培养周期（通常24–72 h）结束后收集条件培养基。
• 于4 °C依次以300 × g离心10 min去除细胞，2,000 × g离心20 min去除死细胞和大碎片，10,000 × g离心30 min去除大型囊泡和凋亡小体，取澄清上清液用于后续操作。
• 立即处理样品，或分装后于−80 °C保存，避免反复冻融。

尿液：

• 在无菌条件下收集中段尿液至洁净容器中，应在收集后4 h内处理，或于−80 °C保存。
• 于4 °C以2,000 × g离心10 min去除细胞和碎片，再以10,000 × g离心30 min去除较大颗粒，收集澄清上清液。
• 尿液样品可能需要将pH调节至7.0–7.4，并建议添加蛋白酶抑制剂混合物以保护外泌体蛋白质货物。

分离操作规程（逐步工作流程）

以下工作流程适用于经样品制备章节所述预清除步骤后的细胞培养条件培养基和尿液样品。

1. 体积测量：测量澄清样品的体积，调整至产品说明书推荐的体积范围。
2. 加入试剂：按产品数据表规定的比例加入Exosome Isolation Reagent（通常为每1体积样品加入0.2体积试剂）。充分振荡混合或反复颠倒至均匀。
3. 孵育：按产品说明书规定的时间在4 °C孵育混合物（通常过夜或按指示操作）。保持一致的孵育时间有助于提高重现性。
4. 离心：将孵育后的混合物于4 °C以1,500 × g离心30 min，小心吸去并丢弃上清液，避免扰动沉淀。
5. 重悬：根据预期下游应用，将沉淀重悬于适量无菌1× PBS或随附的重悬缓冲液中，轻柔吹打至均匀悬浮。
6. 储存或下游使用：立即将分离的外泌体用于功能研究，或分装后于−80 °C保存。避免反复冻融，以免损害囊泡完整性。

注意：每次使用时，请务必参阅随批次提供的最新版产品说明书，以获取准确的体积、比例和离心参数，这些参数可能在批次间有所调整。

下游表征与质量控制

在进行功能或生物标志物研究之前，验证外泌体的身份和质量至关重要。推荐的表征方法包括：

• 纳米颗粒追踪分析（NTA）：测定颗粒粒径分布和浓度，外泌体应主要分布在30–150 nm范围内。
• 透射电子显微镜（TEM）：确认在标准电镜固定条件下外泌体特有的杯状形态。
• 典型标志物的Western Blot检测：检测四跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81）和热休克蛋白（HSP70、HSP90）作为阳性标志物；内质网标志物钙网蛋白（calnexin）的缺失可确认制备物未受细胞器严重污染。
• 蛋白质定量：使用BCA或Bradford法测定制备物的总蛋白浓度，以便在实验间进行归一化处理。
• RNA分析：若关注核酸货物，可使用外泌体兼容的RNA分离试剂盒提取RNA，并在测序或RT-qPCR前通过Bioanalyzer或Qubit评估质量。

在实验室内建立质量控制基准（如颗粒-蛋白质比、标志物阳性率）可确保实验间和操作员间的一致性。

故障排查与最佳实践

请参阅以下常见问题及推荐纠正措施：

• 产率低：确保预清除离心步骤不过于剧烈（在试剂盒步骤前避免超过10,000 × g）。确认试剂与样品的比例及孵育时间是否严格执行。对于尿液样品，确保pH在推荐范围内。
• 本底高/蛋白质污染：确认细胞培养时使用了外泌体去除血清。对于尿液样品，处理前对样品进行稀释可减少Tamm-Horsfall蛋白（尿调素）等丰富尿液蛋白的干扰。
• 沉淀形成不良：检查孵育是否在4 °C而非室温下进行。确保样品在孵育过程中未冻结。孵育前将样品与试剂充分混合。
• 批次间结果不一致：标准化细胞传代数、收集时的细胞密度和培养基体积。对于尿液，尽量标准化收集时间和供体水化状态，并将结果归一化至尿肌酐。
• 重悬沉淀中出现聚集体：使用大口径移液管头轻柔重悬。若聚集体持续存在，可将悬浮液通过0.45 µm注射器过滤器过滤（注意：此操作可能降低总颗粒数）。

通用最佳实践：处理过程中将所有样品和试剂置于冰上。使用低吸附微离心管，以减少囊泡粘附于管壁。在所有管上标注批号、日期和样品标识，以确保可追溯性。