植物体内的末端氧化酶有抗坏血酸氧化酶、多酚氧化酶、细胞色素氧化酶、黄酶、交替氧化酶等五种。这个复杂的氧化酶系统有助于植物对外界环境条件的适应。

随着植物的种类不同，氧化酶也不完全一样，植物在生长发育过程中，酶系也发生改变。例如水稻种子在发芽初期以细胞色素氧化酶为主，6～7d后，抗坏血酸氧化酶的作用占主导地位。此外，植物感病后不仅呼吸增强，氧化酶系统也发生相应的变化。例如正常小麦植株的末端氧化酶主要是含铁酶类，叶子感染锈病时为含铜酶类所代替。

由此可见，测定氧化酶的种类与活性对了解植物的代谢情况及其与环境条件的关系有重要意义。通过实验，掌握一种简便快速测定抗坏血酸氧化酶活性的原理和方法。

操作方法

植物体内抗坏血酸氧化酶活性的测定实验

原理

抗坏血酸氧化酶在有氧情况下，能氧化抗坏血酸成脱氢抗坏血酸，同时促进其氢与空气中的氧结合成水。抗坏血酸氧化酶的测定是在该酶的最适pH及适宜的温度下，向反应瓶中加入一定量的底物（抗坏血酸）及酶提取液，让酶作用一段时间，然后测定底物被消耗的数量来计算酶的活性。抗坏血酸被消耗的量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来测定。反应式如下：上述式中I2来自以下反应：KIO3 + 5KI + 6HPO3 --→ 3I2 + 6KPO3 + 3H2O

材料与仪器

水稻黄化幼苗 马铃薯块茎 植物叶片
磷酸盐缓冲液 抗坏血酸 偏磷酸 淀粉溶液 碘酸钾配制 碘液配制
研钵 50 ml量筒 50 ml三角瓶 微量滴定管 滴定架 移液管 移液管架 恒温水浴 洗耳球

步骤

一、实验步骤

1. 酶液提取

称取新鲜样品（水稻黄化苗2～3g，马铃薯块茎用5g）剪碎置研钵中，加少量石英砂及pH6的磷酸缓冲液，迅速研磨成匀浆（事先将缓冲液用冰水冷却，不使研磨时温度增高）。把全部材料用缓冲液洗入50 ml容量瓶中，定容至刻度。放在18～20℃水浴上浸提30min（其间摇动数次）。然后将上清液（酶浸提液）用棉花过滤于干净的三角瓶中备用。

2. 酶活性的测定

取3个50 ml三角瓶，标上号码，按下表准确加入各项试液:

先在各瓶中加入pH6磷酸缓冲液4 ml，0.1％抗坏血酸2 ml, 并向3号瓶加入10％三氯乙酸1 ml，以每隔1 min在各瓶中依次加入酶液3 ml（视酶活性增减酶用量），准确记录加入酶液的时间，摇勺后将各瓶在18～20℃水浴中酶促反应5 min后，立即向1、2号瓶各加入10﹪三氯乙酸1 ml，以终止酶的活动，然后各瓶加入1％淀粉液3滴作指示剂，用微量滴定管以mol碘液进行滴定，以出现浅兰色为滴定终点。记录滴定值。

常见问题

酶活性的计算：

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