本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。

操作方法

在凸出末端上连接接头实验

材料与仪器

T4 噬菌体 DNA 连接酶 多聚核苷酸激酶 限制性内切核酸酶
ATP 乙醇 接头激酶缓冲液 苯酚 氯仿 乙酸钠 TE
层析设备 水浴装置

步骤

一、材料

1. 缓冲液和溶液

ATP (10 mmol/L)，乙醇，10x 接头激酶缓冲液，苯酚：氯仿（1:1, V/V），乙酸钠（3 mol/L, pH 5.2)，TE ( pH 8.0)。

2. 酶及缓冲液

T4 噬菌体 DNA 连接酶，多聚核苷酸激酶，限制性内切核酸酶。

3. 核酸和寡核苷酸

外源或目的 DNA 片段，人工合成的寡核苷酸或接头，用 TE ( pH 8.0) 溶解，终浓度约为 400 ug/ml。

4. 专用设备

层析设备，温度可调至 65℃ 的水浴装置。

二、方法

1. 在一无菌离心管内进行接头的磷酸化：

合成的寡核苷酸或接头 0.5~2.0 ug TE（pH 8.0）溶解，10x 接头激酶缓冲液 1.0 ul，10 mmol/L ATP 1.0 ul，H₂O 加至 10 ul，T4 噬菌体 DNA 连接酶 1.0 单位，反应体系置于 37℃ 温育 1 h。

没有必要钝化出磷酸化的接头，因为可在反应混合物中直接进行连接反应。

2. 磷酸化接头与补平的 DNA 片段连接的反应体系如下：

DNA 片段 100~200 ng，磷酸化接头 摩尔数超过 10~20 倍，10x 连接酶缓冲液 1.0 ul，T4 噬菌体 DNA 连接酶 0.1 Weiss 单位，10 mmol/L ATP 1.0 ul，H₂O 加至 10 ul，连接混合物于 4℃ 放置 6~16 h。

为获得最大效率的连接，反应体系越小越好，一般为 5~10 μl。在反应混合物中，ATP 作为 10X 连接缓冲液的组分，可为载体和外源 DNA 片段的体积提供更大的空间。有些厂家的连接缓冲液中已含有 ATP, 这样在应用时就不必另加 ATP 了。

3. 65℃ 温育连接反应混合物 15 min, 以灭活 DNA 连接酶。

4. 用 10 ul 适当的 10x 限制酶缓冲液稀释连接产物。补加蒸馏水使终体积 100 ul 中含有 50~100 单位的限制酶。

5. 反应体系于 37℃ 温育 1~3 h。

限制酶可从 DNA 片段的末端上除去多聚合体，并形成凸出末端。在反应体系中有大量接头存在，需要用大量限制酶来消化。

6. 用苯酚：氯仿抽提反应混合物一次，然后用乙醇沉淀回收 DNA。

7. 于 4℃ 用微量离心机以最大速度离心 15 min 以收集 DNA 沉淀，用 50 ul TE ( pH 8.0) 重新溶解 DNA 沉淀。

8. 将获得的 DNA 溶液过层析柱，以去除过量的接头及酶切小片段。

9. 经修饰的 DNA 片段现在可被用于与带凸出末端的质粒 DNA 连接。

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