衰老是植物在长期进化和自然选择中形成的一种生物学现象，它可以在植物的细胞、器官和整体等不同水平上表现出来。植物叶片衰老过程中，叶绿素含量下降，叶色变黄，蛋白质含量减少。另外自由基代谢失调并在体内积累也是植物衰老的机理之一。本实验主要是测定植物衰老过程中叶片蛋白质的变化，掌握植物体内可溶性蛋白和非可溶性蛋白的测定原理及方法。

操作方法

植物体内可溶性蛋白和非可溶性蛋白含量的测定实验

原理

植物材料经Tris－HCl缓冲液研磨、离心后，可溶性蛋白质溶于上清液中，非可溶性蛋白则存在于沉淀部分。将沉淀用碱水解，则会得到非可溶性蛋白的提取液。蛋白质提取液与考马斯亮蓝G－250反应呈蓝色。在一定范围内，蛋白质的含量与反应液在595nm波长的吸光度呈正比，由此可求出蛋白质的含量。

材料与仪器

植物叶片
考马斯亮蓝溶液 HCl MgCl2 EDTA 二硫苏糖醇 牛血清蛋白标准母液
高速冷冻离心机 分光光度计 恒温水浴 研钵 试管 移液管 洗耳球

步骤

1. 牛血清蛋白标准曲线的制作

（1）取6支试管，编号，按下表配制每管含量为0～100μg的牛血清蛋白标准液。

加入表中试剂后，摇匀，以0号管为空白对照，在595nm波长处测定其吸光度（A）值。

（2）标准曲线绘制

以牛血清蛋白含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 蛋白质的提取

称取叶片0.3～0.5g，剪碎于冷冻过的研钵中加提取液3 ml，加少量石英砂，在冰浴中快速研磨成匀浆，匀浆倒入离心管中，再用5 ml提取液（分两次）将研钵中匀浆洗入离心管，然后在10000 r/ min，4℃条件下离心20min，上清液即为可溶性蛋白质提取液。

将离心所得的沉淀加3 ml 1mol·L－1NaOH溶液，在90℃恒温水浴中加热20min后，在4000 r / min，4℃条件下离心10min，上清液即为非可溶性蛋白质提取液。

3. 测定

上述两种上清液各取0.1 ml分别放入2支试管中，每管再加Tris缓冲液0.9 ml，空白对照管加Tris缓冲液1 ml，然后各管分别再加入考马斯亮蓝染色液5 ml，摇匀，在595nm波长处测定吸光度（A）值。

五、结果计算

根据所测得的样品液吸光度值，从标准曲线查出蛋白质含量，按下公式计算可溶性蛋白质和非可溶性蛋白质含量。

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