角膜间质细胞，即已知的角膜细胞，表现为静息的表型，以独特的树突状形态为特征，在体内的增殖率非常低下近乎没有。在急性损伤时，角膜细胞开始有丝分裂，呈成纤维细胞形态，迁移至损伤区域。在体外，原代的角膜细胞在无血清或低丝裂原血清培养基中能够维持静止状态，与体内静止的角膜细胞在细胞形态和基质分泌作用方面相似。胎牛血清能够使角膜细胞增殖，但是也能够使角膜细胞变为成纤维细胞或成肌纤维细胞。来源：《人干细胞培养》

操作方法

分离原代人角膜间质细胞

材料与仪器

完整的人角膜
CMF-SaIineG 中性蛋白酶II L型胶原酶 1mg ml在DMEM F-12 GASP中 CMF-SaIineG配制的TrypLEExpress或0.25%膜蛋白酶 DMEM F-12 GASP DMEM F-12 2FB GASP:DMEM F-12 GASP含2%FBS CMF GASP
3.5cm塑料组织培养皿或6孔板 手术刀或单刃的安全刀片 细胞滤网 70μm血液尼龙过滤网 塑料刮片 “CellLifter”或“CellScraper” 弯虹膜剪 11cm(4-3 8in.) Jeweler’s镊 10cm(4in.) 角膜剪 19mm刀刃 尖头 Colibri缝线钳 0.1mm

步骤

(a)用CMF-SalineG清洗角膜3×5 min。

(b)剪除残留的巩膜，结膜和虹膜。

(c)加人2ml 1.2U中性蛋白酶II，4℃摇床摇动过夜。

(d)将加入中性蛋白酶II的角膜4℃摇30 min。

(e)用DMEM/F-12/GASP洗涤角膜。

(f)解剖显微镜下，小心去除上皮和内皮细胞。

(g)用塑料刮片轻刮基膜的上皮细胞面和内皮细胞面。显微镜下观察，以确保完全去除这些细胞层。

(h)用新鲜培养基清洗角膜基质一次。

(i)用手术刀或安全刀片或精细手术剪将基质剪碎成2 mm左右的小块。

(j)用DMEM/F-12/GASP配制的胶原酶37℃消化3 h,直到大多数组织消失。

(k)400g离心10 min,弃上清。

(l)用DMEM/F-12/GASP重悬细胞，用70μm细胞滤网过滤消化液，并离心。

(m)重复上述清洗步骤两遍，每遍之后细胞计数。

(n)用MJM将分离出的间质细胞重悬并以1×10⁴cm²的密度接种于塑料组织培养皿中。

(o)每3天更换一次培养基。

(P)当细胞达90%汇合时用胰蛋白酶消化传代：吸出培养基，用CMF-SalineG洗一次。加人胰蛋白酶或TrypLE至仅仅覆盖细胞，37℃，10 min。加人DMEM/F-12/2FB终止消化。细胞计数。将重悬的细胞离心，弃上清。用足量新鲜配制的MJM培养基将细胞重悬，以1×10⁴cm²的密度接种

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